基因工程抗體

1、基因工程抗體,（genetic engineering antibody）,,隨著DNA重組技術(shù)以及其它分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，人們利用基因工程技術(shù)來制備抗體分子，這種抗體分子稱為基因工程抗體，這是分子水平的抗體。,優(yōu)點,是按人類設(shè)計所重新組裝的新型抗體分子，可保留或增加天然抗體的特異性和主要生物學(xué)活性，去除或減少無關(guān)結(jié)構(gòu)（如Fc片段），從而可克服單克隆抗體在臨床應(yīng)用方面的缺陷（如鼠源單克隆抗體在人體內(nèi)使用會引起抗體產(chǎn)生而降低其效果，F(xiàn)c

2、片段的無效性和副作用）,基因工程抗體的制備過程,首先是獲得抗體基因片段，可從B細(xì)胞DNA庫中篩選；用探針從雜交瘤細(xì)胞、免疫脾細(xì)胞的DNA庫或cDNA庫中篩選；或以PCR法直接擴(kuò)增等。然后將抗體基因片段導(dǎo)入真核細(xì)胞（如雜交瘤細(xì)胞）或原核細(xì)胞（如大腸桿菌），使之表達(dá)具有免疫活性的抗體片段。,目前基因工程抗體有,嵌合抗體（chimeric antibody）重構(gòu)抗體（reshaping antibody）單鏈抗體（single-chai

3、n antibody）Ig相關(guān)分子噬菌體抗體（phage antibody）全套抗體（the immunoglobulin repertoire）基因庫,（一）嵌合抗體（chimeric antibody）,嵌合抗體是指在同一抗體分子中含有不同種屬來源抗體片段的抗體，又稱雜種抗體。迄今構(gòu)建的嵌合抗體多為“鼠－人”類型，也就是抗體的Fab或F(ab)2來源于鼠類，而Fc片段來源于人類。,嵌合抗體制備過程簡介,將小鼠雜交瘤細(xì)胞的免疫

4、球蛋白(Ig)VH基因與人Ig的CH基因連接導(dǎo)入骨髓瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合重鏈再將小鼠雜交瘤細(xì)胞的Ig VL基因與人的CL基因相連轉(zhuǎn)染含嵌合重鏈的小鼠骨髓瘤細(xì)胞篩選分泌鼠－人嵌合抗體的骨髓瘤細(xì)胞,所分泌的嵌合抗體與原雜交瘤細(xì)胞分泌的抗體特異性和親和力相同，但減少了抗體中的鼠源性成分,（二）重構(gòu)抗體（reshaping antibody）,目的：為進(jìn)一步減少鼠源蛋白在嵌合抗體內(nèi)的含量改造：將鼠抗體的超變區(qū)基因嵌入人抗體Fab骨架區(qū)

5、的編碼基因中，再將此DNA片段與人Ig恒定區(qū)基因相連，然后轉(zhuǎn)染雜交瘤細(xì)胞，使之表達(dá)嵌合的V區(qū)抗體。,,本質(zhì)：實際上也就是在人抗體可變區(qū)序列內(nèi)嵌入鼠源抗體的高變區(qū)基因序列，通過這種置換為人類抗體提供了一個新的抗原結(jié)合部位。,（三）單鏈抗體（single-chain antibody）,又稱FV分子。目的：基因工程手段構(gòu)建更小的具有結(jié)合抗原能力的抗體片段，即FV分子或單鏈抗體蛋白。本質(zhì)：是由VL區(qū)氨基酸序列與VH區(qū)氨基酸序列經(jīng)肽連接物（

6、linker）連接而成。此外肽連接物還可將藥物、毒素或同位素與單鏈抗體蛋白相融合。,優(yōu)點,這類抗體具有分子量小，作為外源性蛋白的免疫原性較低；在血清中比完整的單克隆抗體或F(ab)2片段能更快地被清除；無Fc片段，體內(nèi)應(yīng)用時可避免非特異性殺傷；能進(jìn)入實體瘤周圍的微循環(huán)等優(yōu)點。,（四）Ig相關(guān)分子,原理：可將抗體分子的部分片段（如V區(qū)或C區(qū)）連接到與抗體無關(guān)的序列上（如毒素），就可創(chuàng)造出一些Ig相關(guān)分子,可將有治療作用的毒素或化療藥物取代

7、抗體的Fc片段，通過高變區(qū)結(jié)合特異性抗原，連接上的毒素可直接運送到靶細(xì)胞表面，起“生物導(dǎo)彈”的作用。Byrn構(gòu)建的“CD4免疫粘附素”即是這一類抗體分子，他是將CD4基因與IgG1 C區(qū)在體外重組而表達(dá)出的Ig相關(guān)分子，它可封閉人HIV gp120蛋白與CD4＋ T細(xì)胞的結(jié)合，在治療人的愛滋病上具有潛在價值。,應(yīng)用事例,（五）噬菌體抗體（phage antibody）,噬菌體表面展示技術(shù)（phage display technolo

8、gy）。是將已知特異性的抗體分子的所有V區(qū)基因在噬菌體中構(gòu)建成基因庫，用噬菌體感染細(xì)菌，模擬免疫選擇過程，具有相應(yīng)特異性的重鏈和輕鏈可變區(qū)即可在噬菌體表面呈現(xiàn)出來。,展望,基因工程抗體由于將抗體基因置于人的操作之下，抗體分子的大小、親和力的高低、對細(xì)胞毒性的強弱，以及是否接上其它有用的分子等都可根據(jù)治療和診斷的要求進(jìn)行設(shè)計，這是雜交瘤技術(shù)所不及的，因此有著強大的生命力。從構(gòu)建的人和動物抗體基因總文庫中篩選和表達(dá)針對任一抗原的抗體基

9、因，將結(jié)束僅依靠免疫獲得抗體的狀況。,催化抗體（catalytic antibody）,催化抗體也叫抗體酶（abzyme），是具有催化活性的免疫球蛋白，它兼具抗體的高度選擇性和酶的高效催化性1986年Lerner和Schultz兩個研究小組各自獨立發(fā)表了他們關(guān)于抗體酶的第一篇報告以來，抗體酶的研究已取得了相當(dāng)廣泛的成功。,,催化抗體制備技術(shù)的開發(fā)預(yù)示著可以人為生產(chǎn)適應(yīng)各種用途的，特別是自然界不存在的高效催化劑，對生物學(xué)、化學(xué)和醫(yī)藥等多

10、種學(xué)科有重要的理論意義和實用價值。,（二）催化抗體的制備,催化抗體（抗體酶）技術(shù)是化學(xué)和免疫生物學(xué)的研究成果在分子水平交叉滲透的產(chǎn)物，是將抗體的極其多樣性和酶分子的巨大催化能力結(jié)合在一起的蛋白質(zhì)分子設(shè)計的新方法，故而顯示出較高的理論和實用價值，成為酶工程領(lǐng)域中的研究熱點。,,在親和性和結(jié)合特異性方面，抗體－抗原的相互作用與酶-底物的相互作用相似。,,抗體與處于穩(wěn)定、低能構(gòu)型的抗原作用，而酶與處于不穩(wěn)定、高能的過渡態(tài)底物結(jié)合。酶結(jié)合能量幫

11、助打開底物分子的化學(xué)鍵?？贵w酶的結(jié)構(gòu)應(yīng)該與底物過渡態(tài)互補。但這種過渡態(tài)往往只存在短時間，所以研究者必須先制備底物過渡態(tài)的穩(wěn)定低能類似物，然后制備抗體酶。,目前制備催化抗體有以下四種方法：,1．細(xì)胞融合法 2．抗體結(jié)合位點化學(xué)修飾法 3．引入輔助因子法 4．基因工程抗體技術(shù),1．細(xì)胞融合法,首先通過化學(xué)反應(yīng)合成反應(yīng)物的過渡態(tài)類似物，這類類似物通常是半抗原，經(jīng)與載體蛋白偶聯(lián)，研制針對該過渡態(tài)類似物的特異單抗，亦即抗體酶。這種單抗與

12、反應(yīng)物的過渡態(tài)結(jié)合降低了反應(yīng)的活化能，從而加速該反應(yīng)的進(jìn)行。如催化碳酸脂水解的抗體MOPC167即以此法制備。,2．抗體結(jié)合位點化學(xué)修飾法,對抗體酶進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾的關(guān)鍵是找到一種溫和的方法在抗體結(jié)合位置或附近引入具有催化功能的基團(tuán)。游離巰基就是適合的基團(tuán)之一，它具有高親核性，易于氧化，及能通過二硫化物進(jìn)行交換反應(yīng)或親電反應(yīng)而選擇性修飾的特點。,3．引入輔助因子法,很多天然酶活性中心都含有金屬離子。Lerner等將金屬離子引入抗體酶，成功

13、地催化了肽鍵的選擇性水解。用三乙撐胺Co3+鹽作為金屬離子輔因子，所用半抗原分子帶有一肽鍵。且通過羧酸根及仲胺基與金屬離子相連。將此半抗原通過共價鍵連接在載體蛋白上免疫動物后產(chǎn)生的抗體，在金屬離子復(fù)合物作為輔因子的參與下，這些抗體酶能選擇性水解甘氨酸和丙氨酸之間的肽鍵，其轉(zhuǎn)化數(shù)達(dá)6×10－4。,4．基因工程抗體技術(shù),該技術(shù)在抗體酶制備中具有誘人的前景。應(yīng)用噬菌體抗體展示技術(shù)或全套抗體基因庫，并輔以計算機模擬，為篩選特定目的高