抗人L-PGDS基因工程抗體的構(gòu)建及表達(dá).pdf

1、Lipocalin型前列腺素D合成酶(Lipocalin-typeProstagladinDSynthase，L-PGDS)亦稱β-trace蛋白，是機(jī)體組織屏障的主要成分，屬Lipocalin家族。L-PGDS主要分布于哺乳動(dòng)物的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和雄性生殖器官，并分泌至腦脊液、血清、精液、尿液、羊水等體液中。L-PGDS是一種雙功能蛋白，除催化PGD2產(chǎn)生外，亦可結(jié)合和運(yùn)輸親脂/疏水分子。該蛋白具有廣泛的生理學(xué)作用，它不僅與睡眠誘導(dǎo)、體溫

2、調(diào)節(jié)、感受傷害、氣味應(yīng)答等有關(guān)，亦是一種生育相關(guān)蛋白，可能參與精子的發(fā)生和成熟。研究表明，L-PGDS與許多疾病密切相關(guān)，如L-PGDS不同程度地表達(dá)于卵巢癌、乳腺癌等組織，病毒性腦膜炎、腦脊膜瘤、椎管狹窄、腦栓塞等病人的CSF中L-PGDS明顯升高。 為了建立L-PGDS的免疫學(xué)檢測方法并探討其在男性生殖系統(tǒng)中的具體功能、代謝過程、作用機(jī)制以及與男性不育的關(guān)系等，該實(shí)驗(yàn)室以畢赤氏酵母表達(dá)了人睪丸L-PGDS抗原，成功制備了兔抗

3、人L-PGDS多克隆抗體和鼠抗人L-PGDS單克隆抗體。兔源多抗實(shí)際上是多種抗體的混合物，具有不均一性，無論是對抗體分子結(jié)構(gòu)與功能的研究還是臨床應(yīng)用都受到很大限制；而特異性鼠單抗具有異源性，應(yīng)用于人體研究會引發(fā)人抗鼠抗體的毒性反應(yīng)，并使抗體在體內(nèi)消除加快等。因此，應(yīng)用于臨床的理想抗體應(yīng)是人源的，但人-人雜交瘤技術(shù)目前尚未突破，且還存在人-人雜交瘤體外傳代不穩(wěn)定、抗體親合力低及產(chǎn)量不高等問題。目前解決此問題的較好辦法之一是研制基因工程抗體

4、，代替鼠源單抗應(yīng)用于臨床。本研究試?yán)没蚬こ碳夹g(shù)，構(gòu)建和表達(dá)目前研究較多也較成熟的單鏈抗體、人—鼠嵌合抗體，為L-PGDS的功能性研究以及臨床相關(guān)疾病的診斷、治療奠定基礎(chǔ)。 該研究第一部分首先采用RT-PCR技術(shù)，以一組自前導(dǎo)序列的簡并引物，從1株穩(wěn)定分泌抗人L-PGDS單抗的鼠雜交瘤細(xì)胞中擴(kuò)增出抗體的輕鏈可變區(qū)基因2個(gè)、重鏈可變區(qū)基因1個(gè)；然后分別克隆至pGEM-T載體，并測序。測序結(jié)果表明，其中1個(gè)Vκ為鼠骨髓瘤細(xì)胞系中固

5、有的無功能基因；另一Vκ和VH經(jīng)KabatIg比對分析，與其同源性較高的序列均為鼠免疫球蛋白可變區(qū)基因，且堿基序列符合鼠抗體可變區(qū)特征。 該研究第二部分利用一柔性連接短肽[(Gly)4Ser]3SOEPCR法將上述重、輕鏈可變區(qū)拼接成完整的抗人L-PGDS單鏈抗體基因，并裝入表達(dá)載體pET-28a(+)，在BL21宿主菌中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE檢測顯示，在低劑量0.02mMIPTG誘導(dǎo)和在較低溫度25℃或28℃下培養(yǎng)，重組

6、菌表達(dá)了一定量的可溶性單鏈抗體。后經(jīng)Ni-NTA親和層析柱純化，得率為2mg/100ml，純度達(dá)92％；雙夾心ELISA和免疫熒光競爭抑制實(shí)驗(yàn)證實(shí)，純化后的抗人L-PGDS單鏈抗體具有較好的親和力和特異性。 該研究第三部分選用嵌合抗體輕、重鏈分別表達(dá)載體，利用限制性雙酶切位點(diǎn)，將上述輕、重鏈可變區(qū)基因構(gòu)建成人—鼠嵌合輕鏈表達(dá)質(zhì)粒pAG4622/VL和人—鼠嵌合重鏈表達(dá)質(zhì)粒pAH4604/VH。重組輕、重鏈表達(dá)質(zhì)粒先后經(jīng)DOTAP