基因工程緒論

1、,緒 論,The formation of new combinations of heritable material by the insertion of nucleic acid molecules，produced by whatever means outside the cell， into any virus, bacterial plasmid or other vector system so as to allow

2、 their incorporation into a host organism in which they do not naturally occur but in which they are capable of continued propagation.,第一節(jié) 基因工程的誕生,在體外對不同生物的遺傳物質(zhì)（基因）進(jìn)行剪切、重組、連接，然后插入到載體分子中（細(xì)菌質(zhì)粒、病毒或噬菌體DNA)，轉(zhuǎn)入微生物、植物或動物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行

3、無性繁殖，并表達(dá)出基因產(chǎn)物。,一、基因工程的定義,二、基因工程誕生的理論基礎(chǔ),1 . DNA是遺傳物質(zhì),1952年Alfred Hershy和Marsha Chase進(jìn)一步證明遺傳物質(zhì)是DNA。,1944年 Avery，確定了基因的分子載體是DNA，而不是蛋白質(zhì)。,（1）肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗,（2）噬菌體轉(zhuǎn)染實驗,1953年James D. Watson和Francis H. C. Crick揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)和半保留復(fù)制機制。

4、,,2. DNA雙螺旋結(jié)構(gòu),1957年Crick又提出了遺傳信息傳遞的“中心法則”,DNA,RNA,protein,,,,1964年Marshall Nirenberg和Gobind Khorana等終于破譯了64個遺傳密碼,3. 中心法則和遺傳密碼,三、基因工程誕生的技術(shù)突破,1. 限制性內(nèi)切酶（restriction enzymes）,1970年H.O. Smith等分離出第一種限制性核酸內(nèi)切酶。,Werner Arber 理論預(yù)

5、見限制酶,Daniel Nathans 用限制酶切得SV40 DNA片斷,Hamilton O. Smith 得到第一個限制酶,1978年Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎,,2. DNA連接酶（ligase）,1967年5個實驗室?guī)缀跬瑫r發(fā)現(xiàn)了DNA連接酶。,3. 載體（vector）,1972年前后使用小分子量的細(xì)菌質(zhì)粒和?噬菌體作載體。在細(xì)菌細(xì)胞里的大量擴增。,4. 感受態(tài)體系,1970年M. Mandel和A. Higa發(fā)現(xiàn)經(jīng)過氯化鈣

6、處理的大腸桿菌容易吸收噬菌體DNA。1972年S. Cohen發(fā)現(xiàn)這種處理過的細(xì)菌同樣能吸收質(zhì)粒DNA。,5. 瓊脂糖凝膠電泳,1960s發(fā)明了瓊脂糖凝膠電泳，可將不同長度的DNA分離開。,6. DNA測序技術(shù),1975年F. Sanger、A. Maxam和W. Gilbert發(fā)明了DNA快速測序技術(shù)。,,1980年Nobel化學(xué)獎,四、基因工程的誕生,1980年Nobel化學(xué)獎,1972年斯坦福大學(xué)的Paul Berg小組完成了首次

7、體外重組實驗：,1. Berg的開創(chuàng)性實驗,將SV40的DNA片斷與?噬菌體的DNA片斷連接起來。,（用DNA末端轉(zhuǎn)移酶，而非限制性內(nèi)切酶）,2. Boyer-Cohen實驗,1973年斯坦福大學(xué)的S. Cohen小組將含有卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質(zhì)粒與含有四環(huán)素抗性基因的另一種大腸桿菌質(zhì)粒pSC101連接成重組質(zhì)粒，具有雙重抗藥性。,后來又把非洲爪蟾核糖體基因片斷同pSC101質(zhì)粒重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，并在菌體內(nèi)成功轉(zhuǎn)錄出相應(yīng)

8、的mRNA。這是第一次成功的基因克隆實驗。,,Boyer-Cohen實驗,,Stanley Cohen 1986 Nobel生理或醫(yī)學(xué)獎,Herb Boyer,外源DNA在寄主細(xì)胞內(nèi)可大量擴增，和高水平表達(dá)。,1. 跨物種性,2. 無性擴增,外源基因到另一種不同的生物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行繁殖。,五、基因工程的特征,2. 重組體的制備,六、基因工程的主要操作內(nèi)容,1. 目的基因的獲取,從復(fù)雜的生物基因組中，經(jīng)過酶切消化或PCR擴增等步驟，分離出帶

9、有目的基因的DNA片斷。,將目的基因的DNA片斷插入到能自我復(fù)制并帶有選擇性標(biāo)記（抗菌素抗性）的載體分子上。,將重組體（載體）轉(zhuǎn)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中。,4.克隆鑒定,3.重組體的轉(zhuǎn)化,挑選轉(zhuǎn)化成功的細(xì)胞克?。ê心康幕颍?。,5.目的基因表達(dá),使導(dǎo)入寄主細(xì)胞的目的基因表達(dá)出我們所需要的基因產(chǎn)物。,基因工程,制造帶有抗生素抗性基因或有產(chǎn)生病毒能力的基因的新型微生物有可能在人類或其它生物體內(nèi)傳播。,1. 對環(huán)境的影響,2. 新型病毒的出現(xiàn),重

10、新組合一種在自然見尚未發(fā)現(xiàn)的的生物性狀有可能給現(xiàn)有的生態(tài)環(huán)境帶來不良影響。,一、基因工程的安全隱患,第二節(jié) 基因工程的安全性,將腫瘤病毒或其它動物病毒的DNA引入細(xì)菌有可能擴大癌癥的發(fā)生范圍。,4. 人造生物擴散,新組成的重組DNA生物體的意外擴散可能會出現(xiàn)不同程度的潛在危險。,3. 癌癥擴散,1. 公眾的擔(dān)憂,二、重組DNA研究的安全準(zhǔn)則,1973年美國的公眾第一次公開表示擔(dān)心應(yīng)用重組DNA技術(shù)可能會培養(yǎng)出具有潛在危險性的新型微生物

11、，從而給人類帶來難以預(yù)料的后果。,1974年美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）考慮到重組DNA的潛在危險，提請Paul Berg博士組成一個重組DNA咨詢委員會。,這個由11名分子生物學(xué)和重組DNA權(quán)威學(xué)者組成的委員會在同年7月發(fā)表公開信（science,158,303)，要求在沒有弄清楚重組DNA所涉及的危險性范圍和程度，以及在采取必要的防護措施之前，暫停兩類試驗（帶抗生素抗性和腫瘤病毒及動物病毒）。,2. 專家的態(tài)度,3.制定安全規(guī)則,1

12、976年6月23日，NIH正式公布了“重組DNA研究的安全準(zhǔn)則”。,規(guī)定了安全防護（物理防護和生物防護）標(biāo)準(zhǔn)以及禁止若干類型的實驗。 1979年、1981年、1989年NIH又做了多次修改，放寬了許多限制。,,分4級：P1—P4級。,（1）實驗室的物理安全,4. 基因工程的安全措施,一般裝備良好的普通微生物實驗室。,① P1級實驗室,② P2 級實驗室,在P1級實驗室的基礎(chǔ)上還裝備有負(fù)壓的安全操作柜。,全負(fù)壓的實驗室，同時裝備安全操作

13、柜。,④ P4級實驗室,專用的實驗大樓，周圍與其它建筑物應(yīng)有隔離帶。 具有最高安全防護措施。,③ P3 級實驗室,在自然環(huán)境中無法存活。,（2）實驗室的生物安全,分3 級（大腸桿菌）：EK1—EK3級。,① EK1級的大腸桿菌,在自然環(huán)境中一般都要死亡。,② EK2-EK3級大腸桿菌,第一個“安全”菌株是K12（1976年），很不實用，已淘汰。,（3） 載體的安全,應(yīng)該是失去了自我遷移的能力。,不會自動從“安全”的菌株轉(zhuǎn)移到“不安全”

14、的菌株中。 （容易構(gòu)建）。如pMB9，pBR322等。,一、基因工程在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用,1. 提高植物的光合作用效率,第三節(jié) 基因工程的應(yīng)用,改變與光合作用有關(guān)的酶的結(jié)構(gòu)和組成（如二磷酸核酮糖羧化酶）。,（1）提高CO2的固定率,改變光能交換系統(tǒng)的分子的基因結(jié)構(gòu)。,（2）提高光能吸收率和轉(zhuǎn)化率,使非固氮植物轉(zhuǎn)變?yōu)楣痰参锘蚰芘c根瘤菌共生固氮。,2. 提高豆科植物的固氮效率,是農(nóng)業(yè)生物技術(shù)的主要內(nèi)容。 是將克隆到的特殊基因?qū)胧荏w植

15、物，使之增加一些優(yōu)質(zhì)性狀（高產(chǎn)、穩(wěn)定、優(yōu)質(zhì)、抗蟲、抗病等）。,3. 轉(zhuǎn)基因植物,世界各國轉(zhuǎn)基因作物大田釋放情況（1987.1-1998.4）,中國已經(jīng)批準(zhǔn)進(jìn)入大田的轉(zhuǎn)基因植物（1998.3）,,,將外源基因?qū)雱游锛?xì)胞，并在基因組內(nèi)穩(wěn)定整合，遺傳給后代。 使動物成為生物反應(yīng)器生產(chǎn)有用的活性蛋白等。,4. 轉(zhuǎn)基因動物,在乳汁中分泌人組織纖溶酶源激活物（TPA）和尿激酶的轉(zhuǎn)基因小鼠； 分泌a1抗胰蛋白酶的轉(zhuǎn)基因山羊等。,二、基因工程在工

16、業(yè)中的應(yīng)用,克隆各種參與纖維素降解的酶的基因，導(dǎo)入釀酒酵母，就可能利用廉價的纖維素來生產(chǎn)葡萄糖，發(fā)酵成酒。,用外源基因改造釀酒酵母，產(chǎn)生優(yōu)質(zhì)的啤酒?；蛴冕劸平湍干a(chǎn)蛋白質(zhì)等。,1. 纖維素的開發(fā)利用,2. 釀酒工業(yè),三、基因工程在醫(yī)藥上的應(yīng)用,1976年，27歲的風(fēng)險投資人Robert Swanson與University of California的教授Herb Boyer共飲了幾杯啤酒，討論了基因工程技術(shù)的商業(yè)前景。討論結(jié)束時，他們

17、決定建立一個公司，并取名為Genentech（Genetic Engineering Technology）。,第一個基因工程公司在學(xué)術(shù)界和商業(yè)界的滿腹懷疑中誕生了！,Genentech的驕人業(yè)績,,制造新型疫苗（如HIV、乙肝、丙肝、霍亂、痢疾、SARS）,2. 用微生物生產(chǎn)藥物,3. 技術(shù)設(shè)計高效高特異性的生物制劑,4. 研制疫苗,1. 用轉(zhuǎn)基因植物或動物生產(chǎn)藥物,大腸桿菌或酵母菌生產(chǎn)激素（如胰島素）、干擾素等,應(yīng)用定點突變技術(shù)設(shè)計

18、蛋白質(zhì)或酶的結(jié)構(gòu)，制造出高效高特異性的生物制劑,美國已批準(zhǔn)上市的基因工程藥物（1997.7）,,,,1,中國已經(jīng)批準(zhǔn)上市的基因工程藥物（1998.5）,,,6. 法醫(yī)鑒定,7.基因治療,5. 基因診斷,將正常的外源基因?qū)氚屑?xì)胞中以彌補靶細(xì)胞所缺失或突變的基因、或抑制異常表達(dá)的基因。,基因病、腫瘤、心血管病、糖尿病等。,（仍在探索階段）,,醫(yī)藥,藥物基因組學(xué),人工設(shè)計,克隆P450s,疾病的動物模型,治療性小分子,植物,微生物,診斷用蛋

19、白,治療性蛋白,微生物,動物,疫苗,植物,微生物,治療性核酸,基因治療,基因修復(fù),反義藥物,,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA疫苗,,診斷性核酸,遺傳病,傳染病,,,,用帶有重組質(zhì)粒的“超級菌”分解油（烷烴類）、有機農(nóng)藥污染。,四、基因工程在環(huán)境保護中的應(yīng)用,1. 檢測水污染,2. 生物降解,用重組細(xì)菌或轉(zhuǎn)基因魚等檢測水污染,生物技術(shù)的發(fā)展在某種程度上是由商品經(jīng)濟 的發(fā)展所推動的。,Genentech公司1980年上市后20分鐘

20、內(nèi)由35$漲到89$/股。,一、商業(yè)投資支持現(xiàn)代生物技術(shù)研究,第四節(jié) 基因工程技術(shù)的商業(yè)化發(fā)展,1980-1983年，美國成立了200多家生物技術(shù)公司。1985年400多家，1300多家。 現(xiàn)在幾乎每個大跨國公司（化學(xué)和制藥）都投巨資。,二、基因工程商業(yè)化特點,1. 技術(shù)密集型,（1）產(chǎn)品來源于實驗室,Boyer教授是Genentech的副總裁。,（2）科學(xué)家往往就是公司的領(lǐng)導(dǎo)人,1994年僅美國的總銷售額40多億美元。 1992年

21、日本4000億日元。 20世紀(jì)末6000億美元。,2. 市場擴張迅速,美國1993年40多億美元。 日本1997年5000多億日元。 80年代初，加拿大聯(lián)邦政府出資參與建立的Allelix生物技術(shù)公司，注冊資本高達(dá)一億美元！,3. 投入巨大,4. 風(fēng)險太高,前期的資金投入是極其巨大的，非一般企業(yè)所能承受。,,我國在“七五”和“八五”計劃的10年間，僅就“基因重組人生長激素”一個項目的研發(fā)就先后投入了近1.5億元人民幣的經(jīng)費。這僅僅

22、是一個仿制型的二類新藥，而且又僅僅是制藥工藝的研發(fā)。長達(dá)10余年的研發(fā)過程，巨額資金的投入，最終也并未獲得高質(zhì)量的“國產(chǎn)二類新藥”。,全世界只有不超過100家生物技術(shù)公司有自己的產(chǎn)品。其中真正盈利的公司很少。,制藥，動物胚胎移植技術(shù)，轉(zhuǎn)基因動植物，農(nóng)作物新品種等。,已取得的成果中60%是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的。,7. 醫(yī)學(xué)生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)進(jìn)展最快,6. 研究專一、產(chǎn)品專一,8. 專門為基因工程實驗提供研發(fā)試劑的公司,5. 產(chǎn)品不斷增加,基因工程的基本步