基因工程重點總結(jié)

1、1第一章 緒 論1、重組 、重組 DNA 技術(shù) 技術(shù)：是指將一種生物體（供體）的基因與載體在體外進(jìn)行拼接重組，然后轉(zhuǎn)入另一種生物體（受體）內(nèi)，使之按照人們的意愿穩(wěn)定遺傳并表達(dá)出新產(chǎn)物或新性狀的 DNA 體外操作程序，也稱為分子克隆技術(shù)。因此，供體、受體、載體是重組 因此，供體、受體、載體是重組 DNA 技術(shù)的三大基本元 技術(shù)的三大基本元件。 件。4、基因工程的基本操作程序（ 、基因工程的基本操作程序（P7）（1）.從供體生

2、物的基因組中分離獲取帶目的基因的 DNA 片段（2）限制性核酸內(nèi)切酶將含有外源 DNA 和載體分子切開(3)DNA 連接酶將含有外源基因的 DNA 片段連接到載體分子上，形成 DNA 重組分子(4)將重組 DNA 分子引入到受體細(xì)胞（5)帶有重組體的細(xì)胞培養(yǎng)拓增，獲得大量的細(xì)胞繁殖群體 （6）篩選和堅定轉(zhuǎn)化細(xì)胞，獲得使外源基因高效穩(wěn)定表達(dá)的記憶工程菌或細(xì)胞(7）將選出的細(xì)胞克隆的目的基因進(jìn)一步演劇分析，并設(shè)法使之實現(xiàn)功能蛋白的表達(dá)第二章

3、 第二章 基因工程的工具酶 基因工程的工具酶一、限制性核酸內(nèi)切酶 一、限制性核酸內(nèi)切酶 P15：是一類能夠識別雙鏈 DNA分子中的某種特定核苷酸序列（4—8bp） ，并由此處切割DNA 雙鏈的核酸內(nèi)切酶hsd R：編碼限制性核酸內(nèi)切酶hsd M：編碼限制性甲基化酶hsd S：表達(dá)產(chǎn)物協(xié)助酶識別特殊的作用位點。1、粘性末端的意義 粘性末端的意義 P①連接便利 i）不同的 DNA 雙鏈只要粘性末端堿基互補(bǔ)就可以連接。ii）同一個 DNA

4、分子內(nèi)連接：通過兩個相同的粘性末端可以連接成環(huán)形分子。② 5’末端標(biāo)記凸出的 5’末端可用 DNA 多核苷酸激酶進(jìn)行 32P 標(biāo)記。凸出的 3’端可以通過末端轉(zhuǎn)移酶添加幾個多聚核苷酸的尾巴（如 AAA 或 TTT 等）造成人工粘性末端。③ 補(bǔ)平成平齊末端粘性末端可以用 DNA 聚合酶補(bǔ)平成平齊末端。2、同裂酶： 、同裂酶：是不同來源分離出來的不同酶，但具有相同的識別順序，切割 DNA 的方式可以相同，也可不同。如 XmaI和 SmaI3

5、、同尾酶： 、同尾酶：它們是不同的酶，但切割后可產(chǎn)生相同的粘性末端，因此同尾酶的切割片斷之間可以相互連接，這種酶在分子生物學(xué)中有較大的價值。4、遠(yuǎn)距離裂解酶： 、遠(yuǎn)距離裂解酶：這類酶的識別位點與切割位點不一致，它們在某一核苷酸區(qū)域與識別順序結(jié)合，然后滑行到識別順序以外的另一個位點進(jìn)行切割。5、可變酶： 、可變酶：這類酶是 II 型酶中的一個特例，它們的識別順序中的 1 個或幾個核苷酸是可變的，并且其識別順序—般大于6 個堿基對。6、II

6、 型限制性核酸內(nèi)切酶酶解注意事項 型限制性核酸內(nèi)切酶酶解注意事項①濃縮的酶應(yīng)該用緩沖溶液稀釋，稀釋后應(yīng)盡快用完；②保存在 50%甘油中，-20 度條件下；③ 酶切反應(yīng)的時候，最后加酶；④酶從冰箱中取出后應(yīng)該放置于冰上或者冰盒上；⑤酶應(yīng)該分成小份，避免反復(fù)凍融；⑥取酶要用新的滅菌的吸頭，避免污染；⑦加酶的體積不要超過反應(yīng)體系的 1/10。7、影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素 影響限制性核酸內(nèi)切酶活性的因素①DNA 樣品的純度蛋白質(zhì)、酚、氯仿

7、、乙醇、EDTA、SDS 等解決方法：加大酶的用量，1 mg DNA 用 10U 酶加大反應(yīng)總體積，延長反應(yīng)時間。② DNA 甲基化程度③ 反應(yīng)條件高濃度的酶、高濃度的甘油、低離子強(qiáng)度、極端 pH 值等，會使一些核酸內(nèi)切酶的識別和切割序列發(fā)生低特異性，即 Star activity 現(xiàn)象。EcoR I 在正常條件下識別并切割 5‘GAATTC3’序列，但在甘油濃度超過 5%，可切割 5‘PuPuATPyPy3’④酶的純度⑤酶切反應(yīng)的溫度

8、和時間大多數(shù)的內(nèi)切酶，最適反應(yīng)溫度為 37 度，但也有例外，如Sma I 為 25 度。酶解時間可以通過加大酶量而縮短。8、限制性內(nèi)切酶的命名 限制性內(nèi)切酶的命名 二、 二、DNA DNA 連接酶 連接酶1. 1. 兩種 兩種 DNA DNA 連接酶 連接酶（1）大腸桿菌連接酶需要 NAD 作物輔助因子只能連接粘性末端。（2）T4 噬菌體 DNA 連接酶以 ATP 作為輔

9、助因子；不但能連接粘性末端；還能連接齊平末端；RNA:DNA 雜交分子中 RNA 上的缺口。2. 2. T4 T4 噬菌體 噬菌體 RNA RNA 連接酶 連接酶以 ATP 作為輔助因子；催化單鏈 DNA 或 RNA 的5‘-p 與 3’-OH 共價鏈接（1）連接條件 ）連接條件1 必須是兩條雙鏈 DNA。2 DNA3’端有游離的-OH，5’端有一個磷酸基團(tuán)（P） 。3 需要能量3（6）Taq-DNA Taq-DNA 聚合酶 聚合酶?

10、具有耐 95℃左右高溫達(dá) 30min 以上的特性； ? 催化 5’→3’的 DNA 新鏈合成，最適溫度 68～72℃，合成速度 1200bases/min；? 在合成的 DNA 鏈的 3’端常多一個“A” ；? 不具 3’→5’的外切酶活性,即無校正功能，大約每合成 500 個堿基要錯配一個；? 具微弱的 5’→3’的 DNA 外切酶活性。（7）pfu pfu 聚合酶 聚合酶? 具有耐 95℃左右高溫達(dá) 30min 以上的特性； ? 催

11、化 5’→3’的 DNA 新鏈合成，最適溫度 68～72℃，合成速度 600bases/min；? 合成的 DNA 為平端,TA 克隆時要用 Taq 酶加 A；? 合成的 DNA 片段長度在 2kb 以內(nèi)；? 具 3’→5’的外切酶活性,即有校正功能；? 無 5’→3’的 DNA 外切酶活性。（8）Taq Taq Plus Plus I DNA DNA Polymerase Polymerase? 具有耐 95℃左右高溫達(dá) 30min

12、以上的特性； ? 催化 5’→3’DNA 新鏈合成，68～72℃最適；? 可合成 10-30kb 的長 DNA 片段； ? 合成的 DNA 為平端,TA 克隆時要用 Taq 酶加 A；? 具 3’→5’的外切酶活性,有很強(qiáng)的校正功能， 大約每合成 1.6x106 個堿基要錯配一個；? 具微弱的 5’→3’的 DNA 外切酶活性。（9） Pyrobest Pyrobest DNA DNA polymerase polymerase? 高保

13、真性（High Fidelity）和 Pfu 等 DNA 聚合酶相同， Taq 的 10 倍以上。? 良好的擴(kuò)增性能，優(yōu)于 Pfu 等 DNA 聚合酶。? 擴(kuò)增得到的 PCR 產(chǎn)物為平滑末端（10 10）依賴于 依賴于 RNA RNA 的 DNA DNA 聚合酶 聚合酶反轉(zhuǎn)錄酶的基本特性：以 RNA 為模板聚合 cDNA 鏈1 M-MuLV:鼠源 RT, 來源于鼠白血病病毒(Moloney Murine Leukemia Virus)最

14、適溫度 42℃, 以 RNA、DNA 或 RNA∶DNA 雜分子為模板，需引物，需 Mg2+或 Mn2+為輔助因子，具有 RNase H 活性，特異性地對 RNA∶DNA 雜分子中的 RNA 降解2 禽源 RT, 來源于雞成髓細(xì)胞增多癥病毒(Avian Myeloblastosis virus) （特點同上）3 Powerscript? Reverse TranscriptaseCLONETECH 公司的專利產(chǎn)品，源于 M-MuLV

15、的一個點突變。無RNase H 活性，故合成的 cDNA 不會因此變短。具有末端轉(zhuǎn)移酶活性，傾向加 3 個“C” 。用于合成全長 cDNA。三、 三、核酸酶 核酸酶1. 1. 單鏈核酸外切酶：核酸外切酶 單鏈核酸外切酶：核酸外切酶 VII VII（ExoVII ExoVII）大腸桿菌的核酸外切酶 VII 不需要 Mg2+2. 2. 雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 雙鏈核酸外切酶：核酸外切酶 III III（ExoIII ExoIII）大腸桿

16、菌的核酸外切酶 III 特異性地從 3‘端外切3. 3.雙鏈核酸外切酶：λ核酸外切酶（ 雙鏈核酸外切酶：λ核酸外切酶（ λExo Exo）λ核酸外切酶特異性地從 5‘ 端外切4. 4.單鏈核酸內(nèi)切酶： 單鏈核酸內(nèi)切酶：S1 S1 核酸酶 核酸酶S1 核酸酶基本特性：降解單鏈 DNA 的速度比降解雙鏈 DNA 快 75000 倍；Zn2+必需；最適 pH 范圍為 4.0 - 4.3；需要 NaCl 10 - 300 mM；降解

17、單鏈DNA 的速度比降解單鏈 RNA 快 7 倍。5.Bal31 5.Bal31 核酸酶 核酸酶Bal31 核酸酶的基本特性：A: 來自艾氏交替單胞菌（A.espejiana）B: 單鏈內(nèi)切雙鏈外切的核酸酶：Bal31 核酸酶的基本用途：誘發(fā) DNA 突變四、核酸修飾酶 四、核酸修飾酶1. 1.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶5’→3’DNA 聚合酶活性①末端轉(zhuǎn)移酶的特性：? 需要 3’—OH、二甲胂酸緩沖液。? 不需要模板。

18、? 底物可以是單鏈 DNA 是 3’—OH 突出的雙 鏈 DNA平末端在 Co2+代替 Mg2+下也可以。? 隨機(jī)添加的 dNTPs，如果只有一種 dNTP，就添加上同聚物。②末端轉(zhuǎn)移酶的用途：? 同聚物加尾：給外源 DNA 片斷和載體分子分別加上互補(bǔ)的同聚物尾巴，以使它們有效地連接。? 再生酶切位點：便于回收克隆片斷。? 非放射性標(biāo)記 DNA 片斷的 3’端：催化非放射性標(biāo)記物參入 DNA 片斷的 3’端。 （生物素

19、-11-dUTP 等）2.T4 2.T4 多核苷酸激酶 多核苷酸激酶 P35 P35①功能：催化γ磷酸從 ATP 轉(zhuǎn)給雙鏈或單鏈 DNA 或 RNA 的 5’-OH 端。 （不論 5’-OH 端突出與否）如果 ATP 的γ磷酸帶有 32P 標(biāo)記，就會被轉(zhuǎn)移到 DNA 的 5’端。但天然的 DNA 的 5’端都是磷酸化的。②多核苷酸激酶的用途：? 正向反應(yīng)（forward reaction）? 交換反應(yīng)標(biāo)記法反應(yīng)混合物中具有超量(γ-32