食品中羅丹明B的殘留免疫檢測方法的研究.pdf

1、羅丹明B（RB）是一種人工合成的具有鮮桃紅色的三苯甲烷類堿性的染料，我國和歐盟等都不允許在食品中添加。本論文旨在建立羅丹明B的免疫檢測方法。根據(jù)羅丹明B的結(jié)構(gòu)，用混合酸酐法與牛血清白蛋白（BSA）偶聯(lián)，用碳二亞胺法與卵清白蛋白（OVA）偶聯(lián)，制備出免疫原RB-BSA，包被原RB-OVA。通過紫外/可見分光光度計(jì)對合成的人工抗原進(jìn)行鑒定，偶聯(lián)物具備半抗原和蛋白的雙重特征吸收峰，因此可以判斷偶聯(lián)成功?？捡R斯亮藍(lán)法測得免疫原的蛋白濃度，計(jì)算其

2、偶聯(lián)率，偶聯(lián)率為11.67。利用免疫原RB-BSA免疫新西蘭大白兔制備多克隆抗體，采用間接ELISA測定效價、抑制率篩選出特異性好的多克隆抗體。所得的抗血清效價為64000。依此抗血清為基礎(chǔ)，初步建立間接競爭ELISA方法，并通過對包被緩沖液、封閉液、抗體稀釋液、樣品稀釋液（pH、甲醇、NaCl）等條件的優(yōu)化以獲得更好的結(jié)果。最終得到最佳的工作條件即包被液為pH=9.6的碳酸鹽緩沖液，封閉液為含0.1％明膠的包被緩沖液，一抗稀釋液為含0

3、.1％明膠、0.05％Tween-20的磷酸緩沖液，二抗稀釋液為含5％海藻糖、0.5％BSA、0.05％Tween-20的磷酸緩沖液，標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為添加3.6％ NaCl的pH7.4的PBS。
　　 優(yōu)化后最終的到羅丹明B標(biāo)準(zhǔn)曲線。檢測限0.1ng/mL，半數(shù)抑制量（IC50）為1ng/mL，線性范圍為0.1～20ng/mL。包被原濃度為2μg/mL，抗體工作濃度3μg/mL，該抗體具有較強(qiáng)的特異性，與羅丹明 6G、結(jié)晶紫、赤蘚

4、紅、孔雀石綠進(jìn)行交叉反應(yīng)，交叉反應(yīng)率均小于0.1％。羅丹明B在辣椒粉樣品添加回收率為67.87-89.30％，變異系數(shù)小于15％，達(dá)到對羅丹明B殘留快速檢測的要求。
　　 用羅丹明B抗體建立免疫親和柱(IAC)樣品凈化方法，并利用高效液相-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-MS）檢測。對實(shí)際樣品進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)，回收率為65.4-95.30％。其檢測效果與ELISA方法相符，由此可見羅丹明B的ELISA及IAC-LC/MS的檢測方法是羅丹明B食品