級(jí)基因工程期末復(fù)習(xí)材料

1、基因工程復(fù)習(xí)題基因工程復(fù)習(xí)題緒論緒論基因工程：基因工程：按照人們的的愿望，進(jìn)行嚴(yán)密的設(shè)計(jì)，通過(guò)體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，有目的地改造生物種性，使現(xiàn)有的物種在較短時(shí)間內(nèi)趨于完善，創(chuàng)造出更符合人們需求的心的生物類(lèi)型，這就是基因工程。又稱(chēng)重組DNA技術(shù)或遺傳工程基因工程的操作步驟可簡(jiǎn)單概括為：基因工程的操作步驟可簡(jiǎn)單概括為：分、切、接、轉(zhuǎn)、篩、增基因工程特點(diǎn)：基因工程特點(diǎn)：在分子水平表達(dá)和細(xì)胞水平操作表達(dá)構(gòu)建克隆載體是基因工程技術(shù)路線(xiàn)中的

2、核心環(huán)節(jié)中的核心環(huán)節(jié)基因工程工具酶基因工程工具酶指體外進(jìn)行DNA合成、切割、修飾和連接等系列過(guò)程中所需的酶，包括DNA聚合酶、限制性核酸內(nèi)切酶、修飾酶和連接酶。限制性核酸內(nèi)切酶和連接酶是基因工程關(guān)鍵的工具酶?，F(xiàn)在常用的DNA連接酶只有2種，即大腸桿菌DNA連接酶和T4DNA連接酶現(xiàn)代分子生物學(xué)領(lǐng)域理論上三大發(fā)現(xiàn)三大發(fā)現(xiàn)和三大發(fā)明三大發(fā)明對(duì)基因工程的誕生起決定作用：三大發(fā)現(xiàn)：三大發(fā)現(xiàn)：（1）DNA是遺傳物質(zhì)（2）揭示了DNA分子的雙螺旋結(jié)

3、構(gòu)模型和半保留復(fù)制機(jī)理（3）遺傳密碼的破譯和遺傳信息傳遞方式的確定三大發(fā)明：三大發(fā)明：（1）限制性核酸內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)與DNA切割（2）DNA連接酶的發(fā)現(xiàn)與DNA片段的連接（3）DNA重組基因工程載體的研究與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)中為什幺要篩選白斑，即原理是什么？實(shí)驗(yàn)中為什幺要篩選白斑，即原理是什么？有外源DNA片段插入到位于lacZ’的多克隆位點(diǎn)后，就會(huì)破壞α肽鏈的讀碼框，從而不能形成有功能活性的β半乳糖苷酶，因此含有重組質(zhì)粒的克隆往往是白色菌落DNA

4、重組試驗(yàn)中為什么用重組試驗(yàn)中為什么用IPTG不用乳糖？不用乳糖？因?yàn)榕囵B(yǎng)基中的乳糖會(huì)被誘導(dǎo)合成的β—半乳糖苷酶所催化降解，從而使其濃度不斷發(fā)生變化。常用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）、硫甲基半乳糖苷(TMG)第一章第一章核酸的制備核酸的制備知識(shí)點(diǎn)：知識(shí)點(diǎn)：生物體內(nèi)的DNA絕大部分是BDNA形式存在形式存在，（A、B、ZDNA）如何獲得完整的完整的DNA分子或大的分子或大的DNA片段片段，是DNA制備中的一項(xiàng)關(guān)鍵技術(shù)。關(guān)鍵技術(shù)。每一種生物

5、DNA的復(fù)制總是從特定位點(diǎn)起始，這個(gè)位點(diǎn)具有一點(diǎn)的核苷酸序列。將此核苷酸序列區(qū)稱(chēng)為復(fù)制起始位點(diǎn)復(fù)制起始位點(diǎn)DNA的轉(zhuǎn)錄應(yīng)包含轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄區(qū)轉(zhuǎn)錄區(qū)1121處為起錄點(diǎn)。起錄點(diǎn)。在原核生物結(jié)構(gòu)基因原核生物結(jié)構(gòu)基因的起錄點(diǎn)下游不遠(yuǎn)處，總有一個(gè)5—AGGAGG—3’的序列，轉(zhuǎn)錄出mRNA上的5’—AGGAGG—3’序列，與核糖30s亞基16srRNA3’端是5’—CCUCCU—3’互補(bǔ)成為30s亞基識(shí)別和結(jié)合mRNA的位點(diǎn)，把此序列

6、稱(chēng)為SD序列。列。真核生物基因轉(zhuǎn)錄區(qū)部不有SD序列的互補(bǔ)序列幾乎所有真核生物真核生物的染色體DNA都是線(xiàn)形都是線(xiàn)形DNA部分原核生物的染色體DNA也是以線(xiàn)形存在的。而大部分原核生物原核生物的染色體DNA和全部線(xiàn)粒體DNA、葉綠體DNA以及細(xì)菌的質(zhì)粒DNA全是環(huán)狀環(huán)狀DNA分子。分子。環(huán)狀DNA分子一般以超螺旋形式超螺旋形式即cccDNA，DNA一條鏈的一個(gè)磷酸時(shí)為開(kāi)環(huán)開(kāi)環(huán)DNA分子（ocDNA）DNA兩條鏈中相對(duì)應(yīng)的兩個(gè)磷酸二酯鍵同時(shí)斷

7、開(kāi)時(shí)為線(xiàn)形DNA（lDNA）拷貝數(shù)：拷貝數(shù)：指某目的基因在某一生物群體或個(gè)體中存在的個(gè)數(shù).單拷貝就是該基因在基因組中只有一個(gè)多則指有多個(gè)。不同構(gòu)型質(zhì)粒DNA電泳圖核酸分離純化是原則：a保持核酸分子以及結(jié)構(gòu)的完整性b防止核酸的生物降解核酸分離純化的一般程序：材料的選擇與預(yù)處理→破碎細(xì)胞與提取→分離純化DNA純化純化最常用的方法是乙醇沉淀（同時(shí)含有Na離子）、DNA沉淀可用玻璃棒挑或者離心沉淀DNA凝膠電泳的影響因素：帶電顆粒的物理性狀，支

8、持物介質(zhì)，電泳強(qiáng)度，緩沖液離子強(qiáng)度凝膠染色凝膠染色：EB液SYBRGreenⅠGoldview核酸分子雜交技術(shù)基本原理：核酸分子雜交技術(shù)基本原理：具有一定同源性的兩條核酸（DNA或RNA）單鏈在適宜的溫度及離子強(qiáng)度等條件下，可按堿基互補(bǔ)配對(duì)原則高度特意地復(fù)性成雙鏈DNA的化學(xué)降解測(cè)序：的化學(xué)降解測(cè)序：經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影檢測(cè)后可以讀出待測(cè)DNA分子的堿基序列（5→’3’）DNA序列的讀取是逆電泳方向進(jìn)行的序列的讀取是逆電泳方

9、向進(jìn)行的Sanger雙脫氧鏈終止法讀取雙脫氧鏈終止法讀取的堿基序列是待測(cè)DNA模板的互補(bǔ)鏈，而非模板鏈本身DNA純化過(guò)程中的缺點(diǎn)：純化過(guò)程中的缺點(diǎn)：加劇DNA的丟失和損傷的可能性。Sanger中載體的存在不但不會(huì)影響測(cè)序的結(jié)果，反而有利于測(cè)序的進(jìn)行，因?yàn)樵趯?shí)際操作中，引物往往不得與待測(cè)DNA的3’端互補(bǔ)，而是與載體克隆位點(diǎn)的兩側(cè)序列互補(bǔ)，這樣可以測(cè)定完整的DNA序列T—DNAD—DNAoc—DNAl—DNAccc—DNA（2）冷凍樣品的

10、RNA降解1.樣品取材后應(yīng)立即置于液氮中速凍，然后可以移至70℃冰箱保存。樣品要相對(duì)小一點(diǎn)；2.先用液氮研磨，再加裂解液勻漿；3.樣品與裂解液充分接觸前避免融化，研磨用具必須預(yù)冷，碾磨過(guò)程中及時(shí)補(bǔ)充液氮。②問(wèn)題二：②問(wèn)題二：OD260OD260OD280OD280比值偏低比值偏低（1）蛋白質(zhì)污染；（2）苯酚殘留；（3）抽提試劑殘留；（4）設(shè)備限制。③問(wèn)題三：電泳帶型異常③問(wèn)題三：電泳帶型異常（1）非變性電泳：上樣量超過(guò)3ug，電壓超過(guò)6

11、Vcm，電泳緩沖液陳舊，均可能導(dǎo)致28S和18S條帶分不開(kāi)。（2）變性電泳條帶變淡：EB與單鏈的結(jié)合能力要差一些，故同樣的上樣量，變性電泳比非變性電泳要淡一些；（3）甲醛的質(zhì)量不高④問(wèn)題四：下游實(shí)驗(yàn)效果不佳④問(wèn)題四：下游實(shí)驗(yàn)效果不佳（1）RNA降解；（2）抽提試劑的殘留；（3）樣品中雜質(zhì)的殘留；（4）DNA污染。4、已知單鏈、已知單鏈RNARNA的序列，分別用的序列，分別用sangersanger和化學(xué)裂解法測(cè)定其序列，寫(xiě)出操作過(guò)程。？

12、和化學(xué)裂解法測(cè)定其序列，寫(xiě)出操作過(guò)程。？①SangerSanger雙脫氧鏈終止法：雙脫氧鏈終止法：原理：原理：①DNA復(fù)制是以一條鏈為模板，按堿基配對(duì)原則復(fù)制②新合成的鏈③復(fù)制可以在體外進(jìn)行④2’和3’雙脫氧的ddNTP會(huì)使復(fù)制終止（雙脫氧鏈終止）DNA聚合酶能夠利用單鏈DNA作模板，合成出對(duì)應(yīng)的DNA互補(bǔ)鏈，但在反應(yīng)過(guò)程中，如果2’，3’—雙脫氧鏈核苷酸三磷酸底物摻入到寡核苷酸鏈的3’端，DNA鏈的延伸反應(yīng)即被終止。在4個(gè)反應(yīng)體系中分

13、別加入一種ddNTP反應(yīng)底物（ddCTP、ddATP、ddGTP、ddTTP）以及DNA模板、合成引物、DNA聚合酶Ⅰ、一定濃度是dNTP（dCTP、dATP、dGTP、dTTP，其中有一種是帶32P放射性標(biāo)記的），使DNA鏈的合成隨機(jī)終止于某一特定ddNTP。最后通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳和放射自顯影技術(shù)讀出待測(cè)DNA模板的堿基序列。步驟：步驟：1.分離待測(cè)核酸模板2.在4只試管中加入適當(dāng)?shù)囊?、模板?種dNTP(包括放射性標(biāo)記dATP

14、，例如32PdATP和DNA聚合酶（如以RNA為模板，則用反轉(zhuǎn)錄酶），再在上述4只管中分別加入一種一定濃度的ddNTP(雙脫氧核苷酸)。3.與單鏈模板（如以雙鏈作模板，要作變性處理)結(jié)合的引物，在DNA聚合酶作用下從5’端向3’端進(jìn)行延伸反應(yīng)，32P隨著引物延長(zhǎng)摻入到新合成鏈中。當(dāng)ddNTP摻入時(shí)，由于它在3’位置沒(méi)有羥基，故不與下一個(gè)dNTP結(jié)合，從而使鏈延伸終止。ddNTP在不同位置摻入，因而產(chǎn)生一系列不同長(zhǎng)度的新的DNA鏈。4.用

15、變性聚丙烯酰胺凝膠電泳同時(shí)分離4只反應(yīng)管中的反應(yīng)產(chǎn)物，由于每一反應(yīng)管中只加一種ddNTP(如ddATP)，則該管中各種長(zhǎng)度的DNA都終止于該種堿基(如A)處。所以凝膠電泳中該泳道不同帶的DNA3’末端都為同一種雙脫氧堿基。5.放射自顯影。根據(jù)四泳道的編號(hào)和每個(gè)泳道中DNA帶的位置直接從自顯影圖譜上讀出與模板鏈互補(bǔ)的新鏈序列。Sanger雙脫氧鏈終止法的技術(shù)要點(diǎn)雙脫氧鏈終止法的技術(shù)要點(diǎn)①制備單鏈DNA模板，即待測(cè)序的DNA鏈②制備一小段模

16、板鏈③特殊的DNA多聚酶④制備2’和3’雙脫氧的ddNTP②化學(xué)降解法測(cè)序：②化學(xué)降解法測(cè)序：（1）待測(cè)模版DNA分子的制備：一般用限制性?xún)?nèi)切核酸酶將待測(cè)DNA分子切割成250~300bp的片段，然后用堿性磷酸酶除去DNA片段5’端的磷酸根，最后用T4多核苷酸激酶和[r32P]ATP，使DNA片段的5’端帶上放射性核酸標(biāo)記。（2）化學(xué)降解待測(cè)模版的DNA分子：純化并堿變性待測(cè)DNA片段，回收其中的一條單鏈，分裝在4支試管中進(jìn)行上述4組特

17、異性切割反應(yīng)。4組反應(yīng)分別產(chǎn)生大小不同且具有共同標(biāo)記末端的寡核苷酸片段混合物。（3）待測(cè)模版DNA分子的序列分析：通過(guò)聚丙烯酰膠凝膠電泳將上述4組反應(yīng)的寡核苷酸片段進(jìn)行分離，經(jīng)放射自顯影后即可從X光片上讀出DNA序列。5、P87P87實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：DNADNA片段之間的連接片段之間的連接答：如平末端的連接：?直接用T4DNA連接酶?先用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶給平末端DNA分子加上PolydApolyT尾巴后，再用DNA連接?用銜接物

18、連接平末端DNA分子④DNA接頭連接法DNA序列測(cè)定法：DNA的化學(xué)降解測(cè)序法1、不對(duì)稱(chēng)粘性末端：不對(duì)稱(chēng)粘性末端：兩種限制酶消化后，需純化載體以提高連接效率；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)?？杀Ａ?；非重組克隆的背景較低；外源DNA可以定向插入到載體中。2、對(duì)稱(chēng)性粘性末端；對(duì)稱(chēng)性粘性末端；線(xiàn)形載體DNA常需磷酸酶脫磷處理；載體與外源DNA連接處的限制酶切位點(diǎn)?？杀Ａ?；重組質(zhì)粒會(huì)帶有外源DNA的串聯(lián)拷貝；外源DNA會(huì)以?xún)蓚€(gè)方向插入到載