腫瘤的病理診斷基礎

1、檢測GISTs的抗體組合,,CD30,CD20,LMP-1,CD15,典型的霍奇金淋巴瘤,CD30,流式細胞分析術（ flow cytometry , FCM ）,原理 ：將懸浮在液體中分散的細胞微粒一個一個地依次通過檢測區(qū)，細胞流速可達9m/s,當細胞通過微孔與激光呈垂直交匯時就可產(chǎn)生相應的電脈信號，這些代表著多種熒光強度參數(shù)的電信號再經(jīng)過計算機處理，得出相應的供分析使用的點圖、直方圖和三維結構圖。,DNA定量檢測技術及其應用癌前病

2、變的DNA倍體分析：異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個重要標志，應用流式細胞分析癌前病變及不典型增生細胞的DNA含量，可協(xié)助診斷和鑒別不典型增生和早期癌;實體腫瘤DNA分析與預后的關系 .細胞凋亡檢測術：目前檢測凋亡常用的方法是DNA斷點的TUNEL和ISNT法，標記DNA斷裂的3-羥基末端，可用直接或間接標記法,3.癌基因定量技術：測定細胞Cyclin ( 周期蛋白 ) 對細胞周期起重要的調節(jié)作用，使用流式細胞儀測定CyclinA、B、E、D

3、等以了解這些蛋白在細胞周期活動中的變化及作用。此外還可檢測有些抑制細胞分裂作用的細胞周期蛋白，如P21、P16、P18、P27等，他們在細胞周期中也起著很重要的調節(jié)作用。多藥耐藥基因（multi-drug resistant gene,MDR）的表達產(chǎn)物P-170能將抗癌藥物排出細胞外，通過流式細胞儀檢測可以指導臨床用藥。,分子病理學技術在病理診斷和預后中的應用,㈠．原位雜交（In situ hybridization ,ISH）：是一

4、種將分子雜交與組織化學相結合的一項技術，它用標記的DNA或RNA為探針在原位檢測組織細胞內(nèi)特定的DNA或RNA序列。 ㈡．PCR技術： PCR是一種體外試管內(nèi)成百倍地特異性擴增某一DNA片段，其長度一般小于1Kb。在加熱后使DNA雙鏈解鏈之后，用降溫的方法使兩條單鏈按堿基互補原理分別與加入的一對人工合成的寡核苷酸鏈引物結合。在耐熱的DNA聚合酶作用下反應體系中的游離單核苷酸，在引物的引導下，以單鏈DNA為模板，按3ˊ－5ˊ端方向，合成

5、出兩條新的與模板DNA互補的子鏈。重復上述過程，可以使模板DNA以2 n的方式擴增（n為循環(huán)次數(shù)）。,(三）原位PCR (in situ PCR )技術 實驗材料：（1）懸浮細胞；（2）涂片細胞；（3）組織切片。1．直接法原位PCR ( direct in situ PCR ): 特點是使闊增產(chǎn)物直接攜帶標記分子。操作簡便，特異性較差，容易出現(xiàn)假陽性結果，且擴增效率較低。2．間接法原位PCR ( indirect in situ

6、PCR )：主要步驟：標本固定，目的是保持原有組織細胞的形態(tài)結構；滲入，即讓引物﹑核苷酸和酶等反應液進入細胞內(nèi)；原位擴增；原位雜交檢測，用特異性的標記探針對擴增產(chǎn)物進行原位雜交，然后再根據(jù)標記分子的性質用親和組織化學方法或免疫組織化學方法顯示其擴增信號。,原位雜交、PCR、原位PCR的應用：1．檢測內(nèi)源性基因⑴ 固有基因:機體細胞基因形態(tài)學上了解很少，原位PCR的問世，對基因的定位檢測提供了最敏感﹑最有效得手段。⑵ 異?；蜃儺惢?/p>

7、 ：基因突變都可以用原位PCR來進行檢測和研究。2. 檢測外源性基因⑴ 感染基因：病毒基因——現(xiàn)在原位PCR正廣泛用于HBV﹑HIV﹑HPV﹑HSV等病毒性疾病的診斷及相關腫瘤的診斷及研究。細菌基因——用于某些細菌感染性疾病，如結核病及麻風病的診斷。⑵ 導入基因：轉基因細胞，轉基因動物或接受基因治療的患者，都可以用基因檢測的手段對外來基因進行鑒別，并判斷基因導入新環(huán)境后發(fā)生那些突變等。,生物芯片 1. 基因芯片 2.蛋

8、白芯片 3.組織芯片,圖像分析技術在腫瘤病理診斷與研究中的應用,病理診斷和研究一般以定性或半定量描述為主，缺乏精確﹑客觀的量化指標，不同觀察者之間，存在一定的主觀性及誤差，應用多媒體圖像分析技術進行形態(tài)測量分析，使形態(tài)量化，一定程度上解決了這個問題。圖像細胞術（imagecytometry ICM）,將二維平面的圖形結構要素量化并進行分析則；體視學（stereology ）。是由二維圖形結構信息通過數(shù)學統(tǒng)計公式的計算來推論

9、三維結構信息的分析法 在腫瘤診斷與研究中，圖像細胞術主要測量三個方面的參數(shù)。即測量平面形態(tài)參數(shù)的ICM；測量光密度的DNA含量分析；測量呈色反應產(chǎn)物（包括細胞化學﹑免疫組織化學及原位雜交）的ICM.。,㈠．圖像（形態(tài)定量）分析技術 1．良﹑惡性腫瘤的區(qū)別上的應用 2．腫瘤的病理分級上的應用 3．參數(shù)與腫瘤預后的評價㈡．圖像細胞光度技術（二）細胞核DNA倍體狀態(tài)的圖像分析：測量DNA 含量可作為診斷癌細胞的客觀依據(jù)。具有正

10、常DNA含量的細胞稱二倍體（diploid）,而惡性細胞由于其DNA含量與正常不同則稱為非整倍體或異倍體（aneuploid）.適用于各種標本，包括印片﹑涂片﹑石蠟切片﹑冰凍切片﹑新鮮及組織消化后的細胞離心標本，標本采用Feulgen氏法染色，可長期保存及根據(jù)細胞學改變選擇測量對像等優(yōu)點，很適合病理腫瘤研究。有人對比流式細胞術與圖像細胞術，兩者結果相近或后者優(yōu)于前者。,激光掃描共聚焦顯微鏡在病理診斷中的應用,激光掃描共聚焦顯微鏡（co

11、nfocal laser scanning microscope—CLSM）能通過對細胞內(nèi)部非侵入式光學斷層對細胞或組織內(nèi)部進行定位檢測，并可重建三維結構模擬像直接對觀察對像的三維結構數(shù)據(jù)進行定量分析。CLSM的主要結構有：計算機系統(tǒng)、激光照射系統(tǒng)、顯微鏡系統(tǒng)、X-Y平臺系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)等,用于以下幾方面的研究：①細胞、組織光學切片，三維圖像重建，并可將重見建圖像進行旋轉觀察；②對活細胞內(nèi)酸堿度及細胞離子的動態(tài)定量測定觀察；③、細

12、胞骨架的構成、生物膜結構、和大分子組裝等的研究；④細胞間通訊的研究；⑤免疫熒光的定量分析；⑥細胞膜流動性測定和光活化技術。,This is the microscopic appearance of a higher grade liposarcoma,At high magnification, the lipoblasts in this liposarcoma are visible.,This schwannoma was

13、 resected from a nerve. Note the circumscribed nature of this benign neoplasm.,A duble-layered cuboidal epithelium is demonstrated in the fibroadenosis,This is the histologic appearance of fibrocystic changes in breast