結(jié)腸癌組織蛋白質(zhì)組成分的雙向凝膠電泳分析

1、<p>　　結(jié)腸癌組織蛋白質(zhì)組成分的雙向凝膠電泳分析</p><p>　　【摘要】 目的 分析結(jié)腸癌病人癌組織、癌旁組織及正常結(jié)腸黏膜組織雙向凝膠電泳的蛋白質(zhì)表達(dá)圖譜，尋找差異表達(dá)的蛋白質(zhì)。方法 采用固相pH梯度雙向凝膠電泳分離結(jié)腸癌病人配對(duì)癌組織、癌旁組織及正常結(jié)腸黏膜組織的總蛋白，銀染顯色，PDQuest 2DE軟件分析差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)果 獲得了重復(fù)性較好的雙向凝膠電泳銀染圖譜。圖像分析顯示

2、，3組膠的平均匹配率分別為：癌組織87.3%、癌旁組織80.3%、正常結(jié)腸黏膜組織84.0%。等電聚焦方向上的平均偏差為（1.16±0.29）mm，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)方向上的平均偏差為（1.00±0.38）mm。差異分析共獲得164個(gè)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)。結(jié)論 雙向凝膠電泳分離結(jié)腸癌組織的總蛋白可獲得重復(fù)性較好的結(jié)果。獲得的差異蛋白質(zhì)點(diǎn)為尋找結(jié)腸癌早期診斷的分子標(biāo)記物提供了理論依據(jù)。

3、 </p><p>　　【關(guān)鍵詞】 結(jié)腸腫瘤 蛋白質(zhì)組學(xué) 電泳 凝膠 雙向 </p><p>　?。跘BSTRACT］ Objective To study the protein expression profiles of colon cancer mucosa, mucosa adjacent to cancer, and normal colon mucosa and det

4、ect the differential expression proteins. Methods Immobilized pH gradient twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2 DE), silver staining and PDQuest 2 DE analysis software were used to separate and analyze th

5、e proteome of cancer mucosa, mucosa adjacent to cancer and normal mucosa. Results The 2 DE images were analyzed by PDQuest 2 DE softwa</p><p>　?。跭EY WORDS］ Colonic neoplasms; Proteomics; Electrophoresis, ge

6、l, TwoDimensional </p><p>　　結(jié)直腸癌是當(dāng)前全球最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率在我國(guó)呈逐年上升趨勢(shì)。近幾十年來(lái)，隨著基因組學(xué)研究的不斷進(jìn)展，結(jié)直腸癌的發(fā)病機(jī)制得到一定的闡明，診斷和治療上也取得了重大進(jìn)展，但對(duì)病人的臨床處理和預(yù)后沒有實(shí)質(zhì)影響，究其原因主要是不能解決早期診斷的問題[1]。蛋白質(zhì)組學(xué)的出現(xiàn)使人們能直接從蛋白質(zhì)的整體水平動(dòng)態(tài)定量地考察腫瘤發(fā)生過(guò)程中蛋白質(zhì)種類、數(shù)量的

7、改變，有助于尋找腫瘤早期診斷和預(yù)后的特異性標(biāo)記物及有效的治療靶標(biāo)[2～4]。本文利用固相pH梯度雙向凝膠電泳（2DE）和2DE凝膠分析軟件，從整體水平上觀察、分析結(jié)腸癌病人癌組織、癌旁組織及配對(duì)正常結(jié)腸黏膜蛋白質(zhì)表達(dá)差異，旨在建立三者間的蛋白質(zhì)表達(dá)差異圖譜，為進(jìn)一步尋找與結(jié)腸癌發(fā)生、發(fā)展相關(guān)的分子標(biāo)記物提供理論依據(jù)，進(jìn)而服務(wù)于結(jié)腸癌的臨床診斷和治療。 </p><p><b>　　1 材料和方法

8、 </b></p><p><b>　　1.1 材料 </b></p><p>　　1.1.1 標(biāo)本 </p><p>　　手術(shù)切除的4例配對(duì)結(jié)腸癌組織、癌旁黏膜組織（距離癌組織&gt;5 cm）、正常結(jié)腸黏膜組織（遠(yuǎn)端切緣），由浙江大學(xué)附屬第二醫(yī)院病理科鑒定并提供，-70 ℃貯存?zhèn)溆谩２∪诵g(shù)前未接受任何治療。 <

9、;/p><p>　　1.1.2 試劑 </p><p>　　尿素、甘氨酸、Tris、SDS、過(guò)硫酸胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、3[(3膽酰胺丙基)二乙胺]1丙磺酸（CHAPS）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺、礦物油、固相pH梯度(IPG) 緩沖液（Biolyte）及干膠條(pH 4～7)，均購(gòu)自BioRad公司；硫脲為Sigma公司產(chǎn)品。 </p><p

10、>　　1.1.3 儀器 </p><p>　　Protean IEF cell等電聚焦儀、Protean Plus Dodeca Cell、PDQuest 2DE軟件、GS800成像儀，均為BioRad產(chǎn)品。 </p><p><b>　　1.2 方法 </b></p><p>　　1.2.1 樣品制備 </p>

11、<p>　　在液氮條件下將組織研磨成粉末，加入細(xì)胞裂解液（尿素7 mol/L， 硫脲2 mol/L，CHAPS 40 g/L，DTT 65 mmol/L，體積分?jǐn)?shù)0.002 Biolyte）并超聲，室溫靜置20 min，然后用離心機(jī)13 000 r/min、4 ℃離心1 h，取少量上清用Bradford法定量[5]，其余上清液分裝-70 ℃凍存。 </p><p>　　1.2.2 固相pH梯度雙

12、向凝膠電泳 </p><p>　?、俚谝幌蚬滔鄍H梯度等電聚焦：主要按GORG等[6]的方法和Protean IEF cell等電聚焦系統(tǒng)指南進(jìn)行。將總蛋白質(zhì)提取物（200 μg）與水化液（尿素7 mol/L，硫脲2 mol/L，CHAPS 40 g/L，DTT 65 mmol/L，體積分?jǐn)?shù)0.002 Biolyte，痕量溴酚藍(lán)）充分混合，總體積為300 μL。水化和等電聚焦在Protean IEF cell

13、上，于17 ℃下自動(dòng)進(jìn)行，程序設(shè)置為：被動(dòng)水化12 h，250 V慢速升壓30 min， 1 000 V快速升壓2 h，10 000 V線性升壓3 h，10 000 V快速升壓。②第二向SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳：等電聚焦結(jié)束后，IPG膠條分別在含20 g/L DTT和25 g/L碘乙酰胺的平衡液（含6 mol/L 尿素，20 g/L SDS，0.375 mol/L TrisHCl、pH 8.8，體積分?jǐn)?shù)0.20甘油）中各平衡15 mi

14、n。將平衡后的膠條移至1.0 mm厚的120 g/L的SDSPAGE膠，使用10 g/L低熔點(diǎn)瓊脂糖封頂，200 V恒壓電泳至溴酚藍(lán)條帶遷移至距底邊1～2 cm處。③銀染：用體積</p><p>　　1.2.3 凝膠圖像分析 </p><p>　　銀染顯色的凝膠通過(guò)GS800掃描儀獲取圖像，用PDQuest軟件對(duì)圖像進(jìn)行背景消減、斑點(diǎn)檢測(cè)、匹配和獲取斑點(diǎn)位置坐標(biāo)等，斑點(diǎn)位置的重復(fù)性

15、按CORBETT等[7]的方法進(jìn)行計(jì)算。 </p><p><b>　　2 結(jié) 果 </b></p><p>　　2.1 結(jié)腸癌組織、癌旁組織和正常結(jié)腸黏膜組織的雙向電泳圖譜 </p><p>　　在相同條件下對(duì)每例病人的正常結(jié)腸黏膜組織、癌旁組織和結(jié)腸癌組織的總蛋白樣品分別進(jìn)行了3次雙向凝膠電泳，其總蛋白分布模式非常相似（圖1）。經(jīng)GS

16、800圖像采集和PDQuest2DE軟件分析，在相同條件下，正常結(jié)腸黏膜組織、癌旁組織和結(jié)腸癌組織識(shí)別的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)數(shù)分別為（1 087±40）、（1 048±11）和（1 137±11）個(gè)，各凝膠中斑點(diǎn)的平均匹配率分別為84.0%、80.3%和87.3%。結(jié)果表明，第一向等電聚焦（IEF）的平均偏差為（1.16±0.29）mm，第二向SDSPAGE方向上的斑點(diǎn)位置偏差為（1.00±0

17、.38）mm。 </p><p>　　2.2 結(jié)腸癌組織、癌旁組織及正常結(jié)腸黏膜組織中蛋白表達(dá)差異分析 </p><p>　　PDQuest軟件分析顯示，有80個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅存在于癌組織中（圖2），有3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅出現(xiàn)在癌旁組織中，有10個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅出現(xiàn)在正常黏膜組織中（圖3）；癌組織與正常黏膜組織、癌旁黏膜組織相比，有19個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)表達(dá)上調(diào)且大于5倍，其中有1個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)呈現(xiàn)從正常到癌旁到

18、癌逐漸增高且增高大于5倍的趨勢(shì)（圖3）；正常黏膜組織與癌組織、癌旁黏膜組織相比，上調(diào)相差5倍的蛋白質(zhì)點(diǎn)有41個(gè)，其中有2個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)呈現(xiàn)從正常到癌旁到癌逐漸降低且降低低于5倍的趨勢(shì)；癌旁組織中有11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)消失（圖4），有4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)明顯低于正常黏膜組織和癌組織，且癌組織與正常黏膜組織相比，這4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)的表達(dá)上調(diào)大于5倍。 </p><p><b>　　3 討 論 </b></p&

19、gt;<p>　　蛋白質(zhì)組學(xué)是后基因組時(shí)代生命科學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域，它從動(dòng)態(tài)和整體的角度，研究組織細(xì)胞中全蛋白質(zhì)的表達(dá)模式和功能模式，為闡明生理病理?xiàng)l件下生物體的生命活動(dòng)規(guī)律提供了強(qiáng)有力的工具[2～4]。目前用于蛋白質(zhì)組學(xué)研究的主要技術(shù)之一是雙向凝膠電泳技術(shù)[2,4,6]，我們通過(guò)反復(fù)摸索，建立了分辨率高、重復(fù)性好的雙向凝膠電泳方法系統(tǒng)，這保證了我們進(jìn)行腫瘤蛋白質(zhì)組差異分析的基本條件。在本次實(shí)驗(yàn)中，在IEF方向上的平均位

20、置偏差為（1.16±0.29）mm，SDSPAGE方向?yàn)椋?.00±0.38）mm，說(shuō)明本次實(shí)驗(yàn)2D電泳的重復(fù)性好，所得的結(jié)果是可靠的。 </p><p>　　結(jié)直腸癌的發(fā)生是一個(gè)涉及多基因、多蛋白改變的復(fù)雜過(guò)程，原癌基因激活、抑癌基因失活及其編碼產(chǎn)物的過(guò)度表達(dá)，以及DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)缺陷等均在腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化和增殖失調(diào)中扮演重要角色。為了客觀地了解結(jié)腸癌發(fā)生過(guò)程中總蛋白的變化趨勢(shì)，本文分

21、析比較了4例結(jié)腸癌病人配對(duì)癌組織、癌旁黏膜組織及正常結(jié)腸黏膜組織的總蛋白表達(dá)圖譜，結(jié)果得到164個(gè)有意義的差異表達(dá)蛋白質(zhì)點(diǎn)，這些蛋白質(zhì)點(diǎn)可能參與了腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。在這些差異表達(dá)的蛋白質(zhì)點(diǎn)中，我們尤為感興趣的是在癌旁黏膜中表達(dá)發(fā)生變化的一些蛋白。目前，對(duì)癌旁黏膜表達(dá)發(fā)生變化的一些蛋白的性質(zhì)尚無(wú)定論，有觀點(diǎn)認(rèn)為其產(chǎn)生主要是源于癌組織的旁分泌或癌細(xì)胞浸潤(rùn)造成的局部微環(huán)境的改變，在分子水平上它反映的是一種癌前病變的狀態(tài)[8]。王康等[9]通過(guò)

22、對(duì)結(jié)腸癌、癌近旁黏膜、癌遠(yuǎn)旁黏膜和正常組織的研究顯示，結(jié)直腸癌旁黏膜有一定的癌變潛能，尤其是癌近旁黏膜。本研究結(jié)果表明，有11個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅在正常組織中和癌組織中有表達(dá)，而在癌旁組織中消失；有3個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)僅出現(xiàn)在癌旁黏膜中；還有4個(gè)蛋白質(zhì)點(diǎn)在癌旁組織中的表達(dá)明顯低于正常組織和癌組織。說(shuō)明某些蛋白質(zhì)在癌癥的發(fā)生過(guò)程中起一過(guò)性的作</p><p>　　當(dāng)然，單純的雙向電泳并不能滿足蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需要，我們進(jìn)一步的工作

23、是對(duì)篩選出來(lái)的這些差異蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行質(zhì)譜分析，明確這些蛋白質(zhì)的身份及生物學(xué)功能，闡明其在腫瘤發(fā)生的各個(gè)階段中的具體作用，并對(duì)其在臨床診斷和治療上的應(yīng)用進(jìn)行可行性評(píng)估。 </p><p><b>　　【參考文獻(xiàn)】 </b></p><p>　　[1]來(lái)茂德. 結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制研究進(jìn)展[J]. 中華病理學(xué)雜志, 2000,29(6):450452. </p&g

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