堿脅迫下野生大豆葉片蛋白質(zhì)組的雙向電泳分析.pdf

1、土壤鹽堿化是一個(gè)世界性的資源問(wèn)題和生態(tài)問(wèn)題，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國(guó)約有9913萬(wàn)公頃鹽堿地，鹽堿逆境嚴(yán)重制約我國(guó)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。開(kāi)發(fā)利用鹽堿地是保持我國(guó)農(nóng)業(yè)持續(xù)高效發(fā)展、保證我國(guó)糧食安全亟待解決的重大問(wèn)題。野生大豆（Glycine soja）是栽培大豆的近緣野生型，具有優(yōu)異的耐鹽堿、抗寒和抗病害能力，是我國(guó)寶貴的野生資源財(cái)富。野生大豆不僅具有極高的耐堿性（可在pH＞10的土壤中生存），還可降低鹽堿土中水溶性鹽離子的含量。因此，研究野生大豆的耐堿機(jī)

2、理，對(duì)培育耐堿作物、控制和利用鹽堿土有重要作用。蛋白質(zhì)是植物生命活動(dòng)的直接執(zhí)行者。因此，通過(guò)雙向電泳技術(shù)構(gòu)建野生大豆在逆境脅迫下的蛋白表達(dá)譜，篩選差異表達(dá)蛋白，分析堿脅迫下野生大豆差異表達(dá)蛋白的表達(dá)模式對(duì)研究其耐逆機(jī)制具有重要的作用。
　　本研究以課題組前期篩選的耐堿野生大豆G07256為試材，為探討其耐堿特性，以50mmol·L-1 NaHCO3對(duì)其進(jìn)行脅迫處理。檢測(cè)了7個(gè)與堿脅迫相關(guān)的生理指標(biāo);建立了野生大豆葉片蛋白質(zhì)組雙向電

3、泳體系;構(gòu)建了堿脅迫下野生大豆葉片的差異蛋白質(zhì)表達(dá)譜，初步分析了差異表達(dá)蛋白的等電點(diǎn)、分子量分布和表達(dá)模式。本研究為獲得堿脅迫應(yīng)答相關(guān)的差異蛋白奠定了良好的基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果如下:
　　1.堿脅迫下野生大豆的生理指標(biāo)分析
　　為了解野生大豆的耐堿特性，以50mmol·L-1 NaHCO3模擬堿脅迫，處理21日齡的野生大豆幼苗，檢測(cè)了葉片中MDA、脯氨酸、可溶性糖、SOD、POD、CAT、和ROS7個(gè)生理指標(biāo)，在堿處理0h，6

4、h，12h，24h和48h的累積量和活性變化。其中，MDA、脯氨酸和可溶性糖均于處理48h時(shí)達(dá)到最大累積量;SOD、POD和CAT三種酶活性分別于6h、24h和48h達(dá)到最高;ROS累積量在12h最高，48h時(shí)降低到正常水平。可見(jiàn)，野生大豆通過(guò)可溶性糖和脯氨酸的大量積累和SOD、POD、CAT三種酶的有序表達(dá)來(lái)抵抗堿脅迫。
　　2.野生大豆葉片蛋白質(zhì)組雙向電泳體系的建立
　　為建立分辨率高、重復(fù)性好的雙向電泳體系，對(duì)Tris

5、-飽和酚法、Tris-HCl法和TCA-丙酮法3種蛋白質(zhì)提取方法提取的野生大豆葉片總蛋白的質(zhì)量和效率進(jìn)行了比較，并對(duì)蛋白上樣量、等電聚焦參數(shù)及凝膠濃度進(jìn)行了優(yōu)化。最終建立了以Tris-飽和酚法提取蛋白質(zhì)、上樣量為2000μg、等電聚焦90000V·h、凝膠濃度為10％的雙向電泳體系。利用該體系可獲得背景清晰、蛋白點(diǎn)數(shù)較多、重復(fù)性較好的蛋白雙向電泳圖譜。
　　3.堿脅迫下野生大豆葉片差異表達(dá)蛋白組的分析
　　為獲得野生大豆堿脅

6、迫應(yīng)答蛋白。利用上述雙向電泳體系，對(duì)50mmol·L-1 NaHCO3脅迫0h、6h、12h、24h和48h的野生大豆葉片進(jìn)行蛋白質(zhì)的提取和雙向電泳，為確保雙向電泳重復(fù)性，每個(gè)處理時(shí)間至少3次重復(fù)。利用PDquest軟件對(duì)凝膠進(jìn)行分析，每?jī)蓚€(gè)處理時(shí)間點(diǎn)相比較，以fold＞1.5，P＜0.05為閾值篩選差異表達(dá)蛋白，共獲得101個(gè)蛋白點(diǎn)發(fā)生了顯著變化。差異蛋白點(diǎn)的分子量主要分布在20-60kD之間，等電點(diǎn)主要分布于5.6-6.0之間。幾個(gè)