鹽脅迫下青楊葉片蛋白質(zhì)組的雙向電泳體系構(gòu)建與差異表達(dá).pdf

1、土壤鹽漬化是陸地生態(tài)系統(tǒng)中的重要脅迫生境類型之一，對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)的植被分布和植物生理生化性狀產(chǎn)生了顯著影響。如何改良和利用鹽堿化土地成為當(dāng)前一個(gè)迫切需要解決的科學(xué)問題。提高植物的耐鹽性是改良和利用鹽漬化土壤的一個(gè)重要生物學(xué)措施。要選育高耐鹽性的植物品種，必須深入研究植物的耐鹽機(jī)理。傳統(tǒng)的研究多集中在少數(shù)基因的轉(zhuǎn)入和表達(dá)領(lǐng)域，難以揭示植物耐鹽的綜合機(jī)理。蛋白質(zhì)是各項(xiàng)生理功能的執(zhí)行者，是生命現(xiàn)象的直接體現(xiàn)者，對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能的研究可以直接

2、闡明植物在鹽脅迫條件下的變化機(jī)制。 雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳是研究蛋白質(zhì)核心技術(shù)之一，但此法仍具有重復(fù)困難、樣品上樣量相對(duì)較少，低豐度蛋白質(zhì)很容易被高豐度蛋白所掩蓋、一些相對(duì)分子質(zhì)量高或極酸、極堿的蛋白質(zhì)無(wú)法分離等不足之處。楊樹是開展分子生物學(xué)研究的模式植物之一，青楊(Populus cathayana)是楊屬的典型物種。本文以青楊葉片為材料，研究鹽脅迫生境條件下青楊葉片中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，但鑒于其組織富含色素、多酚、多糖、有機(jī)酸

3、等次生代謝物質(zhì)，樣品制備較難。因此，在進(jìn)行鹽脅迫青楊葉片蛋白質(zhì)組的研究之前，必須首先構(gòu)建和優(yōu)化適合青楊葉片蛋白質(zhì)的雙向電泳體系；在此基礎(chǔ)上，以正常條件下生長(zhǎng)的青楊為對(duì)照，研究鹽脅迫生境條件下青楊葉片中蛋白質(zhì)的表達(dá)差異，期望有助于進(jìn)一步闡明植物的耐鹽機(jī)理，培育高耐鹽性的新品種。本文主要結(jié)論如下： (1)通過單、雙向的SDS-PAGE發(fā)現(xiàn)，用酚抽法得到的蛋白質(zhì)條數(shù)要比改良丙酮沉淀法和TCA-丙酮沉淀法獲得的條帶數(shù)多，經(jīng)ImageMa

4、ster 2D Platinum 6.0軟件分析蛋白質(zhì)點(diǎn)有721個(gè)，比TCAI丙酮沉淀法得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多118個(gè)，比改良丙酮沉淀法得到的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)多284個(gè)，且蛋白質(zhì)點(diǎn)呈圓形或橢圓形，比較均勻地分布在凝膠上。 (2)對(duì)于24cm，pH3-10的線性IPG膠條，上樣量為100μg/IPG的膠條獲得的蛋白質(zhì)點(diǎn)數(shù)非常少，低豐度蛋白質(zhì)點(diǎn)模糊不清；上樣量達(dá)300μg/IPG的膠條，檢測(cè)到的蛋白質(zhì)點(diǎn)有600多個(gè)，均勻的分布在膠圖上，所得膠

5、圖橫向與縱向拖尾少；上樣量達(dá)600μg/IPG的膠條上則產(chǎn)生明顯的橫向條紋。 (3)延長(zhǎng)低電壓聚膠時(shí)間，可以使電壓最終達(dá)到8000V，很好的完成等電聚焦。聚焦時(shí)間為90000Vh時(shí)，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰、均勻的分布于整個(gè)圖譜上；聚焦時(shí)間為40000Vh時(shí)，大部分蛋白質(zhì)還沒有運(yùn)動(dòng)到自身的等電點(diǎn)，在膠圖上表現(xiàn)為一些水平的線狀；聚焦時(shí)間為150000Vh時(shí)，則出現(xiàn)陰極漂移現(xiàn)象。 (4)平衡時(shí)間為10min時(shí)，蛋白質(zhì)點(diǎn)有拖尾現(xiàn)象；平衡時(shí)

6、間為20min時(shí)，蛋白質(zhì)點(diǎn)清晰可辨，均勻的分布于整個(gè)圖譜上，是最佳的實(shí)驗(yàn)體系選擇；平衡時(shí)間為30min時(shí)，則造成部分蛋白質(zhì)點(diǎn)丟失。 因此，對(duì)24cm，pH3-10的線性IPG膠條，最佳的電泳體系是：采用酚抽法提取蛋白質(zhì)，上樣量為300μg/IPG的膠條，聚焦時(shí)間為90000Vh，平衡時(shí)間為20min。 (5)利用最佳的電泳體系進(jìn)行鹽脅迫處理與對(duì)照蛋白質(zhì)點(diǎn)的比較，采用ImalzeMaster 2D Platinum 6.0