實(shí)驗(yàn)十聚丙烯酰胺凝膠電泳(sdspage)分離蛋白質(zhì)

1、實(shí)驗(yàn)十實(shí)驗(yàn)十聚丙烯酰胺凝膠電泳（聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDSPAGE）分離蛋白質(zhì)）分離蛋白質(zhì)【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.了解和掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的技術(shù)和原理；2.掌握用此法分離蛋白質(zhì)組分的操作方法?！緦?shí)驗(yàn)原理】在生物化學(xué)、分子生物學(xué)和基因（遺傳）工程實(shí)驗(yàn)中，常常要進(jìn)行蛋白質(zhì)和核酸的分離工作。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PolyacrylaeGelElectrophesisPAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)進(jìn)行蛋白質(zhì)或核酸分離的一種電泳方法。聚丙烯酰

2、胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylae，簡(jiǎn)稱ACR）和交聯(lián)劑N，N甲叉雙丙烯酰胺（NNmethylenebisacrylse簡(jiǎn)稱BIS）在催化劑的作用下聚合交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的凝膠。通過改變單體濃度與交聯(lián)劑的比例，可以得到不同孔徑的凝膠，用于分離分子量大小不同的物質(zhì)。聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：（1）化學(xué)聚合：催化劑采用過硫酸銨，加速劑為NNNN－四甲基乙二胺（簡(jiǎn)稱TEMED）。通常控制這二種溶液的用量，使聚合在1小時(shí)內(nèi)完成

3、。（2）光聚合：通常用核黃素為催化劑，通過控制光照時(shí)間、強(qiáng)度控制聚合時(shí)間，也可加入TEMED加速反應(yīng)。聚丙烯酰胺凝電泳常分為二大類：第一類為連續(xù)的凝膠（僅有分離膠）電泳；第二類為不連續(xù)的凝膠（濃縮膠和分離膠）電泳。一般地，不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳有三種效應(yīng)：①電荷效應(yīng)（電泳物所帶電荷的差異性）；②凝膠的分子篩效應(yīng)（凝膠的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)及電泳物的大小形狀不同所致）。③濃縮效應(yīng)（濃縮膠與分離膠中聚丙烯酰胺的濃度及pH的不同，即不連續(xù)性所致）。因此

4、，樣品分離效果好，分辨率高。SDS即十二烷基硫酸鈉（SodiumDodecylSulfate，簡(jiǎn)稱SDS）是陰離子表面活性劑，它能以一定比例和蛋白質(zhì)結(jié)合，形成一種SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物。這時(shí)，蛋白質(zhì)即帶有大量的負(fù)電荷，并遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了其原來的電荷，從而使天然蛋白質(zhì)分子間的電荷差別降低仍至消除。與此同時(shí)，蛋白質(zhì)在SDS作用下結(jié)構(gòu)變得松散，形狀趨于一致，所以各種SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物在電泳時(shí)產(chǎn)生的電泳遷移率的差異，僅僅取決于蛋白質(zhì)的分子量。另外，SDS

5、蛋白質(zhì)復(fù)合物在強(qiáng)還原劑（巰基乙醇）存在下，蛋白質(zhì)分子內(nèi)二硫鍵被打開，這樣分離出的譜帶即為蛋白質(zhì)亞基。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對(duì)數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=KbX，式中：MW為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)。本實(shí)驗(yàn)采用化學(xué)聚合法制膠，進(jìn)行不連續(xù)的凝膠電泳，并用考馬斯亮藍(lán)快速染色，以分離和鑒定大腸桿菌菌體、發(fā)酵液中和純化的蛋白產(chǎn)物。【試劑與器材】（一）試劑（(全班分兩大組，每組配一份，如1－

6、5組一份，6－10組一份)（1）30%的凝膠貯備液：ACR30gBis0.8g溶于100mL去離子水中，用3號(hào)新華濾紙過濾至棕色瓶中，4℃避光貯存（1）。（2）3molLTrisbufferpH8.9：Trisbase36.6g1molLHCl48mLddH?O至100mL）（3）0.5molLTrisHClpH6.8:6.05gTrisbase溶于40mLddH?O中，加1molLHCl48mL加水補(bǔ)至100mL.（4）5Tris甘氨

7、酸電泳buffer（pH8.3):（配1L）Trisbase15.1g甘氨酸94g5gSDSH2O至1L（用時(shí)稀釋5倍）。（5）10%SDS:：稱10克SDS溶解于100mL去離子水中，貯存于室溫中。（6）TEMED（四甲基乙二胺）：濃度10%，20mL(全班共用)，4℃保存。（7）10%AP（過硫酸銨）：10mL，新鮮配制，分裝至1.5mL離心管中，－20℃保存待用（2）。在頂層加入幾毫升去離子水覆蓋，以阻止空氣中氧對(duì)凝合的抑制作用。

8、剛加入水時(shí)可看出水與膠液之間有界面，后漸漸消失，不久又出現(xiàn)界面，這表明凝膠已聚合。再靜置片刻使聚合完全，整個(gè)過程約需30分鐘（25℃室溫）。3.濃縮膠的制備：先把已聚合好的分離凝膠上層的水吸去，再用濾紙吸干殘留的水液。按下列配方制備各種體積的濃縮膠溶液：混合后將其注入分離膠上端，插入梳子，小心避免氣泡的出現(xiàn)。4.在濃縮膠聚合的同時(shí)，將蛋白樣品與2x樣品緩沖液等體積混合，置沸水或微量恒溫器（100℃）中加熱3分鐘，馬上插入冰上冷卻待用。5

9、.濃縮膠聚合完全后，將凝膠模板放入電泳槽上固定好，上下槽均加入1X電泳緩沖液，小心地拔出梳子，用移液器沖洗梳孔，檢查有無漏，并驅(qū)除兩玻璃板間凝膠底部的氣泡。6.按次序上樣：用微量進(jìn)樣器往凝膠梳孔中加樣品混合液，所加樣品混合液體積要根據(jù)樣品蛋白濃度而定，一孔加一個(gè)樣品，同時(shí)用已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作對(duì)照。本實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中需要分離鑒定的是純化的GFP蛋白，點(diǎn)樣樣品和次序包括：蛋白蛋白MarkerMarkerpUC18pUC18細(xì)菌總蛋白細(xì)菌總蛋白

10、pGFPpGFP未誘導(dǎo)總蛋白未誘導(dǎo)總蛋白pGFPpGFP加GluGlu及IPTGIPTG誘導(dǎo)總蛋白誘導(dǎo)總蛋白pGFPpGFP加IPTGIPTG誘導(dǎo)破菌后上清總蛋白誘導(dǎo)破菌后上清總蛋白層析時(shí)的穿流峰（雜蛋白）層析時(shí)的穿流峰（雜蛋白）層析時(shí)的洗滌峰層析時(shí)的洗滌峰I層析時(shí)的洗滌峰層析時(shí)的洗滌峰IIIIGFPGFP對(duì)照對(duì)照7.電泳：開始時(shí)電壓為5～8Vcm（約100V）凝膠，待染料濃縮成一條線開始進(jìn)入分離膠后，將電壓增到10～12Vcm（約18