在聚丙烯酰胺凝膠上蛋白質(zhì)、DNA染色方法的研究.pdf

1、目的:
　　 1.探索蛋白質(zhì)染料染色機(jī)理；
　　 2.探索DNA染料染色、負(fù)染機(jī)理；
　　 3.為蛋白質(zhì)組學(xué)研究人員提供合適的染料染色法；
　　 4.為聚丙烯酰胺凝膠上小分子DNA的檢測提供合適的方法。
　　 方法:
　　 1.蛋白質(zhì)染料染色法:采用陰陽離子對技術(shù),選用陰離子染料溶劑藍(lán)和陽離子染料尼羅藍(lán)組成離子對,確定最佳固定時(shí)間、染色時(shí)間、洗脫時(shí)間,同時(shí)考察染色液中的其它成分如鹽離子、甘

2、油等的作用,建立蛋白質(zhì)染料染色操作步驟。
　　 2.DNA染料染色法:選用乙基紫染料,考察影響染色結(jié)果的各個(gè)因素,如染色液的組成、染色時(shí)間、脫色時(shí)間等,建立乙基紫DNA染料染色操作步驟。
　　 3.DNA負(fù)染染色方法:選用曙紅染料,考察影響染色結(jié)果的各個(gè)因素,如染色液的組成、固定時(shí)間、染色時(shí)間、水洗時(shí)間,重點(diǎn)考察鹽離子對染色結(jié)果的影響,建立DNA負(fù)染染色操作步驟。
　　 結(jié)果:
　　 1.建立了蛋白質(zhì)染料

3、染色法,靈敏度達(dá)4-8 ng/band,略高于傳統(tǒng)的考馬斯亮藍(lán)染色法,其操作步驟如下:
　　 (1)固定:電泳后,凝膠放入50 ml固定液固定30 min,固定液為40％7,醇/10％乙酸溶液；
　　 (2)染色:棄去固定液,把凝膠放入50 ml染色液中染色30 min,染色液的組成為0.002％溶劑藍(lán)/0.002％尼羅藍(lán)/24％乙醇/7％乙酸溶液；
　　 (3)脫色:在50 ml脫色液中脫色5 min,脫色液為

4、24％7,醇/7％乙酸溶液。
　　 2.建立了DNA染料染色法,靈敏度達(dá)0.8-1.6 ng/band,是尼羅藍(lán)染色法的八倍(6.4-12.8 ng/band),略低于溴化乙錠染色法(0.4-0.8 ng/band),其操作步驟如下:
　　 (1)染色:電泳后,凝膠放入50 ml染色液中染色20 min,染色液為0.0008％的乙基紫去離子水溶液；
　　 (2)脫色:在50 ml50％乙醇中脫色1 min；

5、>　　 (3)水洗:去離子水水洗1 min。
　　 3.建立了DNA負(fù)染染色方法,靈敏度達(dá)0.05-0.1 ng/band,其操作步驟如下:
　　 (1)固定:電泳后,凝膠放入50ml固定液固定20min。固定液的組成為50％甲醇/7％7,酸溶液；
　　 (2)染色:在25 ml染色液中染色20 min。染色液的組成50 mM ZnCl2/0.4％曙紅/50％甲醇/20％甘油；
　　 (3)水洗1-3