05 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)--聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質(zhì)

1、聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離血清蛋白質(zhì)【目的目的】1掌握圓盤電泳分離血清蛋白的操作技術(shù)。2熟悉聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理?！驹碓怼繋щ娏Ｗ釉陔妶鲋邢蛑c其自身電荷方向相反的電極移動(dòng)，稱為電泳。聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）就是以聚丙烯酰胺凝膠作為電泳介質(zhì)的電泳。在電泳時(shí)，蛋白質(zhì)在介質(zhì)中的移動(dòng)速率與其分子的大小，形狀和所帶的電荷量有關(guān)。聚丙烯酰胺凝膠是一種人工合成的凝膠，是由丙烯酰胺（Acr）單體和少量交聯(lián)

2、劑NN亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）在催化劑過硫酸銨（Ap）和加速劑四甲基乙二胺（TEMED）的作用下發(fā)生聚合反應(yīng)而制得的（其化學(xué)結(jié)構(gòu)式見第2篇第1章）。聚丙烯酰胺凝膠具有網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，其網(wǎng)眼的孔徑大小可用改變凝膠液中單體的濃度或單體與交聯(lián)劑的比例來加以控制。根據(jù)血清蛋白分子量的大小，學(xué)生實(shí)驗(yàn)一般選用7％聚丙烯酰胺凝膠分離血清蛋白質(zhì)。不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳利用濃縮效應(yīng)、分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)的三重作用分離物質(zhì)（見第2篇第1章），使樣品分離效果好

3、，分辨率較高。一般醋酸纖維薄膜電泳只能把血清蛋白質(zhì)分離出5～7條帶，而聚丙烯酰胺凝膠電泳卻能分離出十幾條到幾十條來（圖34），是目前較好的支持介質(zhì)，應(yīng)用十分廣泛。圖34血清蛋白聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜1丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺一般性的分析工作，用分析純的Acr和Bis即可，精細(xì)的分析工作，尤其是分子量的測定和定量分析，需商品Acr和Bis進(jìn)行重結(jié)晶，進(jìn)一步純化。2N，N，N＇，N＇—四甲基乙二胺（TEMED）商品TEMED即可，低溫，避光

4、保存。310%過硫酸銨溶液（AP，WV）10g過硫酸銨定容到10ml，最好使用新鮮配制的溶液。4染色液取三氯乙酸200g加水500ml，然后加入10g考馬斯亮藍(lán)R250用玻璃棒攪拌，待完全溶解后，再加入蒸餾水加至1000ml。5脫色液的配制取三氯乙酸100g加蒸餾水溶解后加至1000ml。6儲(chǔ)備液的配制電極緩沖液、凝膠緩沖液及凝膠儲(chǔ)備液配制見下表：緩沖液Tris5.98g1molLHCl48ml加蒸餾水至100mlPH6.7濃縮膠凝膠儲(chǔ)