盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質

1、盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白質一、實驗目的 1．學習盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的基本原理。 2．掌握盤狀聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作技術。 3．比較醋酸纖維素薄膜電泳與聚丙烯酰胺凝膠 電泳分離血清蛋白質的效果。,二、實驗原理 聚丙烯酰胺凝膠是由單體(monomer)丙烯酰胺(acrylamide，簡稱Acr)和交聯(lián)劑(crosslinker)又稱為共聚體的N，N一甲叉雙

2、丙烯酰胺(methyleme—bisacrylamide，簡稱Bis)在加速劑和催化劑的作用下聚合交聯(lián)成三維網狀結構的凝膠。由于這種凝膠具有分子篩的性質，所以對樣品的分離作用不僅決定于樣品的各組分所帶的電荷的多少，而且也與分子的大小有關。其次，此凝膠電泳還有一種獨特的濃縮效應，因而較醋酸纖維薄膜電泳，瓊脂糖電泳等具有更高的分辨率。,在一定濃度時，凝膠透明，有彈性，機械性能好，化學性能穩(wěn)定，與被分離物不起化學反應，幾乎無電滲作用，樣品不易

3、擴散，用量少(1～100μg)等優(yōu)點。聚丙烯酰胺凝膠電泳應用范圍廣，可用于蛋白質、酶、核酸等生物大分子的分離、定性、定量及少量的制備，還可以測定分子量、等電點等。,(一)聚合反應 聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化劑過硫酸銨(ammonium persulfate，(NH4)2S2O8簡稱AP)或核黃素(ribofavin，即vitaminB2，C17H20O6N4)和加速劑N，N，N’，N’一四甲基乙二胺(N，N，

4、N，N’一tetramethyl ethytenediamine，簡稱TEMED)的作用下，聚合而成的三維網狀結構。催化劑和加速劑的種類很多，目前常用的有2種催化體系。1.AP—TEMED 化學聚合作用 TEMED 是一種脂肪族叔胺，其堿基可催化AP水溶液產生出游離氧原子，然后激活Acr單體形成單體長鏈，在Bis作用下聚合成凝膠。,2．核黃素一TEMED 光聚合作用 TEMED可加速

5、凝膠的聚合，但不加也可聚合。光聚合作用通常需要痕量氧原子存在才能發(fā)生，因為核黃素在TEMED及光照條件下，還原成無色核黃素，后者被氧再氧化形成自由基，從而引發(fā)聚合作用。但過量氧會阻止鏈長的增加，因此應避免過量氧的存在。 用核黃素進行光聚合的優(yōu)點是：核黃素用量少(1 mg／100 m1)，不會引起酶的鈍化或蛋白質生物活性的喪失；通過光照可以預定聚合時間，但光聚合的凝膠孔徑較大，而且隨時間延長而逐漸變小，不太穩(wěn)定，所以用

6、它制備濃縮膠(大孔膠)較合適。,聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacryamide gel electrophoresis簡稱PAGE)根據(jù)其有無濃縮效應，分為連續(xù)系統(tǒng)與不連續(xù)系統(tǒng)兩大類。前者電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷及分子篩效應；后者在電泳體系中由于緩沖液離子成分、pH值、凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應、分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均

7、較前者佳。目前常用的多為垂直的圓盤及板狀兩種。,不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成，它們在直立的玻璃管中(或2層玻璃板中)排列順序依次為上層濃縮膠(大孔膠)、下層分離膠(小孔膠) 。濃縮膠是核黃素催化聚合而成的大孔膠，分離膠是由AP催化聚而成的小孔膠，T=7．O％～7．5％，C=2.5％。凝膠緩沖液為pH8.9 Tris—HCl，大部分血清中各種蛋白質在此 pH條件下，按各自負電荷量及相對分子質量泳動，此膠主要起分子篩作用。,

8、濃縮效應：由于緩沖體系中pH值選擇不一(濃縮膠緩沖液pH6．7，電極緩沖液pH8．3)導致HCl中Cl-幾乎全部解離，甘氨酸中僅O.1％～l％解離為NH2CH2COO-，而蛋白質在這種酸堿度中也解離為蛋白質一COO-。這三種帶負電荷的離子在電泳時，同時向正極泳動，但泳動率不同。Cl-離子泳動最快而居先，稱“前導離子”(1eading ion)， NH2CH2COO-離子最慢而殿后，稱“尾隨離子”(trailing ion)。這樣，在快

9、離子的后面形成一條離子濃度低的低電導區(qū)，從而產生較高的電壓梯度而加速了蛋白質的泳動。又因蛋白質的泳動率介于快慢離子之間得以被濃縮為一條狹窄的盤形帶。,電荷效應：蛋白質在界面上被高度濃縮后，雖形成一條狹帶，但因其中每一組分所帶荷電量不一，因而泳動率也有差異，這就使其各組分按一定順序形成若干圓盤。分子篩效應：當?shù)鞍踪|夾在快慢離子間通過隔層進入分離膠時，尾隨離子由于凝膠的pH值與孔徑的突變導致進一步解離而增速以至超過蛋白的泳動率，使高電區(qū)梯

10、度不復存在。然而蛋白質在這種均一的電壓梯度的條件下，因其各組分的相對分子質量或構型不同，在通過一定孔徑的凝膠時，必然受阻程度不同。這種分子篩效應，使之泳動率仍有差異而得以分離。,本實驗采用垂直管型分析盤狀電泳。凝膠柱用丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺在垂直的玻璃小管中聚合而成。蛋白樣品液放在凝膠柱頂端。整個系統(tǒng)用多相(不連續(xù))緩沖液。當電場通過垂直的凝膠柱時，樣品成分就根據(jù)它所帶的電荷、分子的大小、形狀，以特定的泳動率遷移分離成帶(盤狀)。電泳

11、后，取出凝膠柱作固定和染色處理，顯示特定蛋白質的位置。,三、操作步驟1.準備工作2.分離膠（小孔膠）的制備 在干凈的50ml小燒杯中，分別加入①液1ml；②液2ml，蒸餾水1ml；③液4ml，輕輕搖勻。然后用長滴管吸取此液加入玻璃管中，沿玻管壁緩緩注入蒸餾水，水層3～5mm高，加蒸餾水的目的是防止空氣中的氧妨礙凝膠的形成，以及消除液柱表面的彎月面。,3．濃縮膠(大孔膠)的制備 在小燒杯中，分別加入

12、④液1 ml，⑤液2 ml，蒸餾水1ml，⑥液4 ml，輕輕搖勻，然后放在暗處。 將已制成分離膠的玻管倒立于濾紙上除去水，再用濾紙條吸去殘留的水，注意不要碰到膠面。用滴管吸少量的濃縮膠液洗一下凝膠頂。然后把此凝膠管垂直插在一個支架上(這個支架可用一塊木板，上面釘兩個釘子，長釘之間套兩道橡皮筋制成)，用滴管加上述濃縮膠1.0cm高，上面加水層，操作同分離膠制備。 把以上固定在木板上的凝膠

13、管移至日光燈下(距管lO cm高)照射，進行光聚合。開始顯淡黃色，5～6 min后逐漸轉乳白色，表明聚合開始，繼續(xù)光照20～30 min，使聚合完全。,4.加樣 倒去凝膠上覆蓋的水層，并用濾紙條吸去沾在管壁上的水，再用電極緩沖液洗滌一下膠頂，然后輕輕去除下端膠布，再用電極緩沖液洗去蔗糖液。把凝膠管插到電泳槽的橡皮圈內，注意垂直。電泳槽的下槽先灌注電極緩沖液(注意把母液稀釋10倍)約200 ml，再把上槽安置到下槽上，注

14、意凝膠管下端不要有氣泡，如有氣泡用玻棒輕輕敲玻管即可驅除氣泡。用1ml注射器吸50 ul樣品液（含0.1％溴酚藍指示劑），沿管壁加到濃縮膠頂上，加樣針頭離膠頂1 mm處，勿碰到膠面。然后用滴管沿管壁加電極緩沖液至管頂。最后，在上極槽中倒入電極緩沖液約150 ml。,5．電泳 電泳槽上槽接負極、下槽連正極，然后通電。先恒流：開始用1～2 mA／管，電泳30 min后調至恒壓，電壓為290～300 V(即50 V／管)。

15、電泳過程中要保持電壓穩(wěn)定，否則電壓過高會造成發(fā)熱，使分離失敗。 通電2．5 h左右，待溴酚藍指示液離管底1 cm處停止電泳，取出凝膠管。6．剝膠 用一長針頭注射器吸滿水，將針頭插入凝膠與管壁之間，慢慢旋轉玻管，一邊壓入水，一邊使針頭慢慢呈螺旋式地前進，靠水流壓力和潤滑力將玻管內壁與凝膠分開，最后用吸耳球在玻管一端輕輕加壓，或用針輕輕壓凝膠條，使其滑在干凈的燒杯中。剝膠時注意不要損傷凝膠表面。,7

16、．染色、漂洗 燒杯中加人氨基黑染色液，在90℃水浴中加熱約5min。先用蒸餾水漂洗去膠條表面的染色液，然后再在燒杯中倒入7%醋酸漂洗液，經常更換漂洗液，漂洗2～3天直至背景顏色去除為止。 漂洗凈的膠條可放入裝有7%醋酸溶液的試管中保存，以備鑒定和照相。 8．結果觀察與繪圖,四、實驗建議 電泳時，電泳儀與電泳槽間正、負極不能接錯，以免樣品反方向移動。電泳時應選用合適的電