鐮形扇頭蜱抗凝血分子在昆蟲細胞中的重組表達和RNA干擾研究.pdf

1、蜱是一種常見的動物體表寄生蟲,在生物分類學(xué)上屬于節(jié)肢動物門、蛛形綱、蜱螨目、后氣門亞目、蜱總科。它們在世界各地廣泛分布,侵襲哺乳類、鳥類、爬行類以及兩棲類等動物,是僅次于蚊子的第二大疾病傳播媒介,嚴重危害著人和動物的健康。為了持續(xù)地吸血,蜱的唾液腺分泌大量的生物活性分子。這些生物活性分子包含抗凝血分子,免疫調(diào)節(jié)分子,粘合劑蛋白分子,毒素,抗菌多肽等。它們在蜱對抗宿主凝血系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)和傳播病原體等方面發(fā)揮著重要的作用。為探索新型蜱及蜱傳

2、疾病防治策略,鑒定并研究蜱唾液腺重要生物活性分子的功能是重要內(nèi)容,本研究針對鐮形扇頭蜱的抗凝血分子開展研究。
　　 本實驗室成功構(gòu)建了鐮形扇頭蜱吸血前后的唾液腺抑制消減雜交cDNA文庫,并從cDNA文庫中克隆出兩個具有Kunitz結(jié)構(gòu)域的抗凝血分子編碼基因,命名為Rhipilin-1和Rhipilin-2基因。在此基礎(chǔ)上,本研究以pFastbae HTA為表達載體,構(gòu)建真核表達重組質(zhì)粒Rhipilin-1-pFastbaeHTA

3、、Rhipilin-2-pFastbac HTA。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至DH10 Bac中,抽提重組桿粒Rhipilin-1-Bacmid、Rhipilin-2-Bacmid,將重組桿粒轉(zhuǎn)染至sf9昆蟲細胞內(nèi)進行真核表達,并采用間接免疫熒光和Western blotting的方法對重組表達的蛋白進行了鑒定。結(jié)果分別獲得了大小為24.5kDa的Rhipilin-1重組蛋白和大小為28.3kDa的Rhipilin-2重組蛋白。對重組蛋白Rhipi

4、lin-2進行了抗凝血活性試驗和酶活性抑制試驗,結(jié)果表明,重組Rhipilin-2蛋白,可以顯著延長兔血的部分凝血酶活化時間,具有抗凝血活性。重組Rhipilin-2蛋白的酶活性抑制實驗顯示,對屬于絲氨酸類蛋白的人彈性蛋白酶、胰蛋白酶的抑制作用明顯,并具有濃度依賴特性。
　　 本研究還應(yīng)用了RNA干擾技術(shù),研究了二個抗凝血分子Rhipilin-1和Rhipilin-2的生物學(xué)功能。用含有T7啟動子的方法在體外合成dsRNA,分別

5、以顯微注射的方式注射到蜱體內(nèi),干擾Rhipilin-1和Rhipilin-2目的基因,觀察基因干擾后,對蜱吸血的生物學(xué)特性的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)干擾Rhipilin-1和Rhipilin-2基因后,和對照組相比較,鐮形扇頭蜱的24小時吸附率和飽血重量都明顯下降,表明二個分子在維持蜱正常吸血的過程中具有重要作用。
　　 綜上所述,本研究用桿狀病毒表達系統(tǒng)對鐮形扇頭蜱抗凝血基因Rhipilin-1和Rhipilin-2進行了真核表達,并對