鐮形扇頭蜱抗凝血分子基因的克隆表達(dá)和產(chǎn)物活性分析.pdf

1、蜱是一類專性吸血的節(jié)肢動(dòng)物，不僅是動(dòng)物重要的外寄生蟲(chóng)，還是僅次于蚊子的人和動(dòng)物疾病的第二傳播媒介。與其它的吸血?jiǎng)游锵啾?，蜱的吸血時(shí)間特別長(zhǎng)，一般在10-14天才能達(dá)到飽血狀態(tài)。在蜱吸血過(guò)程中，宿主會(huì)發(fā)生微血管收縮、血小板凝集和血液凝固等凝血反應(yīng)。蜱通過(guò)唾液腺分泌抗凝血分子以克服宿主的凝血反應(yīng)，達(dá)到成功吸血的目的。蜱源抗凝血分子的研究，不僅有助于了解蜱的吸血及病原傳播的復(fù)雜機(jī)制，開(kāi)拓蜱及蜱傳疾病新型防治技術(shù)。而且在開(kāi)發(fā)人類心血管疾病的新型

2、生物制劑上具有潛在價(jià)值。 鐮形扇頭蜱是我國(guó)南方優(yōu)勢(shì)蜱種，我們以吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消減雜交cDNA文庫(kù)中的EST數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，克隆出一個(gè)抗凝血分子編碼基因C18。該基因全長(zhǎng)580bp，編碼164個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為18.04kDa(包括信號(hào)肽)。該蛋白分子在5’端有一個(gè)18個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽序列，并含有一個(gè)典型的抗凝血Kunitz功能域。經(jīng)同源性比較該基因與組織通道抑制因子同源。用RT-PCR方法分析了C18在鐮形扇頭蜱吸

3、血前后的表達(dá)情況，結(jié)果表明C18為蜱吸血后誘導(dǎo)表達(dá)。成功構(gòu)建了重組表達(dá)載體pGEX-4T-1-C18，并轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌BL21中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，結(jié)果表明C18可以在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)，應(yīng)用GST融合蛋白純化系統(tǒng)，可獲得純化的目的蛋白。通過(guò)血漿復(fù)鈣時(shí)間試驗(yàn)和血漿部分凝血酶激活時(shí)間試驗(yàn)對(duì)重組蛋白的抗凝血活性經(jīng)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組蛋白同時(shí)對(duì)內(nèi)源性和外源性的凝血具有明顯抑制作用。 同時(shí)以鐮形扇頭蜱吸血前后雌蜱唾液腺的抑制消減雜交cDNA

4、文庫(kù)中的EST數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，應(yīng)用RACE方法從鐮形扇頭蜱體內(nèi)克隆出另一個(gè)抗凝血基因C201的全長(zhǎng)序列，該基因全長(zhǎng)693bp，開(kāi)放閱讀框編碼195個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)分子量為22.62kDa，該蛋白分子在5’端有一個(gè)20個(gè)氨基酸構(gòu)成的信號(hào)肽序列，并含有一個(gè)典型的抗凝血Kunitz-BPTI功能域。經(jīng)同源性比較該基因與組織通道抑制因子II基因序列高度同源。 綜上所述，本研究首次克隆了鐮形扇頭蜱C201抗凝血蛋白基因，為該基因的進(jìn)一步研究打下