鐮形扇頭蜱半胱氨酸蛋白酶的鑒定及其在唾液腺細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、半胱氨酸蛋白酶是一類(lèi)古老而又保守的蛋白酶，其分布廣泛，涵蓋范圍從病毒、細(xì)菌到哺乳動(dòng)物的各個(gè)組織器官，參與胚胎發(fā)育，抗原呈遞，細(xì)胞凋亡和穩(wěn)態(tài)維持等多種重要的生理活動(dòng)。作為專(zhuān)性體表寄生蟲(chóng)，蜱以吸血宿主血液為生，在其吸血過(guò)程中可傳播細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、原蟲(chóng)等多種病原體，是重要的人畜共患病傳播媒介。唾液腺是宿主血液進(jìn)入蜱體內(nèi)最先接觸的組織器官，也是蜱體內(nèi)病原體傳播到宿主體內(nèi)的通道，因此蜱唾液腺重要分子的研究對(duì)于蜱及蜱傳病控制十分重要；隨著

2、吸血過(guò)程的完成，蜱的唾液腺逐漸萎縮，這一現(xiàn)象是由細(xì)胞凋亡引起的，但分子機(jī)制不清。本研究以蜱的唾液腺中半胱氨酸蛋白酶分子群的鑒定為切入點(diǎn)，探索了半胱氨酸蛋白酶在唾液腺發(fā)育與凋亡中的作用機(jī)制。
　　以鐮形扇頭蜱為研究對(duì)象，對(duì)吸血前、后唾液腺轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測(cè)序及差異分析，分別測(cè)得上調(diào)基因1179個(gè)，下調(diào)基因574個(gè)，其中總轉(zhuǎn)錄庫(kù)中預(yù)測(cè)的半胱氨酸蛋白酶表達(dá)序列標(biāo)簽（EST）有25個(gè)（13個(gè)上調(diào)基因EST，1個(gè)下調(diào)基因EST）；經(jīng)過(guò)基因克隆，共

3、獲得6個(gè)半胱氨酸蛋白酶全長(zhǎng)序列，根據(jù)基因結(jié)構(gòu)和生物信息學(xué)分析，分別命名為組織蛋白酶 B(CATB)、組織蛋白酶L(CATL)、半胱天冬氨酸蛋白酶-1(CASP1)、半胱天冬氨酸蛋白酶-8(CASP8)、自噬相關(guān)蛋白酶4B(ATG4B)和自噬相關(guān)蛋白酶4D(ATG4D)。
　　通過(guò)Real-time PCR方法檢測(cè)了6種半胱氨酸蛋白酶在蜱不同發(fā)育階段和不同吸血狀態(tài)的轉(zhuǎn)錄水平，結(jié)果顯示幼蜱和若蜱吸血后所有蛋白酶的轉(zhuǎn)錄量均顯著性下調(diào)，而

4、在成蜱則全部顯著性上調(diào)；6種蛋白酶在成蜱唾液腺中吸血后轉(zhuǎn)錄量上調(diào)，尤其是CATB和CATL，上調(diào)差異非常顯著，而在其他組織器官中轉(zhuǎn)錄水平各有不同。對(duì)5種半胱氨酸蛋白酶進(jìn)行了體外重組蛋白表達(dá)和純化（CASP8未表達(dá)），并分別制備小鼠特異抗血清。重組蛋白的酶活實(shí)驗(yàn)顯示，各蛋白在適度濃度和PH范圍內(nèi)均表現(xiàn)一定的活性：CASP1的最適PH為5.5，可達(dá)陽(yáng)性對(duì)照酶活性的60％；組織蛋白酶B和L隨著濃度的增加，其活性受到抑制，其中組織蛋白酶L包含一

5、個(gè)60個(gè)氨基酸的抑制結(jié)構(gòu)域，將其切除后可明顯提高組織蛋白酶L的活性，推測(cè)抑制結(jié)構(gòu)域是限制組織蛋白酶L活性的重要因素，而組織蛋白酶 B的高濃度抑制效應(yīng)可能來(lái)自酶與底物的競(jìng)爭(zhēng)；ATG4B和ATG4D對(duì)CASP1特異性底物具有一定活性，可達(dá)陽(yáng)性對(duì)照的40%，ATG4D對(duì)組織蛋白酶特異性底物具有良好活性，高濃度下也出現(xiàn)抑制效應(yīng)。5種重組蛋白的特異性抗血清，可分別識(shí)別成蜱體內(nèi)天然蛋白酶，其中兩種組織蛋白酶CATB和CATL在35~40 kDa之間

6、均有2條帶，可能為酶原和激活態(tài)，而自噬相關(guān)蛋白酶天然蛋白大小分別為~36 kDa(ATG4B)和~40 kDa(ATG4D)，CASP1天然蛋白大小約為37 kDa，在70 kDa左右有類(lèi)似二聚體結(jié)構(gòu)，可能是其真正的活性態(tài)。利用免疫組化技術(shù)，觀察5種半胱氨酸蛋白酶在唾液腺和腸腔中的定位，結(jié)果顯示在唾液腺中5種蛋白酶分布廣泛，而在中腸只可見(jiàn)ATG4D的少量分布。
　　利用RNA干擾技術(shù)，通過(guò)電轉(zhuǎn)化將合成的特異性雙鏈RNA導(dǎo)入鐮形扇頭

7、蜱若蜱體內(nèi)，對(duì)6種半胱氨酸蛋白酶分別進(jìn)行單一干擾實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)6種半胱氨酸蛋白酶之間是否存在相互作用關(guān)系，結(jié)果顯示任一蛋白酶受到抑制均可引起其他5種蛋白酶轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生變化，特別是當(dāng)CATB和CATL轉(zhuǎn)錄受抑制可引起ATG4B和CASP1轉(zhuǎn)錄水平顯著性上調(diào)，而CASP8和ATG4D轉(zhuǎn)錄受抑制時(shí)也引起CASP1轉(zhuǎn)錄水平顯著上調(diào)；當(dāng)CASP1受到抑制后，CATB的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)顯著， ATG4D、ATG4B和CASP8的轉(zhuǎn)錄水平也受到明顯

8、抑制，但CATL的轉(zhuǎn)錄水平未受到影響，推測(cè)CASP1對(duì)于CASP8，CATB，ATG4B和ATG4D可能具有上游調(diào)節(jié)作用，為后續(xù)研究提供了切入點(diǎn)。
　　通過(guò)解剖觀察、Tunnel染色和AnnexinⅤ細(xì)胞凋亡流式檢測(cè)確定了成蜱吸血過(guò)程中細(xì)胞凋亡參與唾液腺的變化過(guò)程；為了探究半胱氨酸蛋白酶在過(guò)程中的作用機(jī)制，利用顯微注射技術(shù)將體外合成的干擾用CASP1雙鏈RNA注射入鐮形扇頭蜱成蜱體內(nèi)，24小時(shí)后接種新西蘭大白兔，分別對(duì)上體后1到7

9、天的對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組成蜱唾液腺進(jìn)行分離觀察，在mRNA和蛋白水平上檢測(cè)7天吸血過(guò)程中半胱氨酸蛋白酶的動(dòng)態(tài)變化，利用Tunnel細(xì)胞凋亡染色和AnnexinⅤ流式細(xì)胞凋亡檢測(cè)技術(shù)對(duì)吸血過(guò)程中唾液腺的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，結(jié)果表明進(jìn)入快速吸血期前（上體3~4天）是唾液腺細(xì)胞誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生的主要時(shí)相，隨后隨著吸血過(guò)程快速完成，唾液腺細(xì)胞逐漸壞死，CASP1作為效應(yīng)性半胱天冬氨酸蛋白酶，在上體后5到7天表達(dá)量逐漸增加；CASP1的干擾可明顯延長(zhǎng)唾液腺細(xì)