泛素水解酶22在同型半胱氨酸誘導(dǎo)膠原蛋白I表達(dá)中的作用研究.pdf

1、目的：
　　高同型半胱氨酸血癥（Hyperhomocystinemia，HHCY）和肝臟纖維化、脂肪肝等肝臟疾病相關(guān)聯(lián)；然而其內(nèi)在的機(jī)制還不為人們所了解。在本文中，我們主要研究泛素水解酶22（ubiquitin carboxyl—terminal hydrolase22，USP22）基因在高同型半胱氨酸血癥誘導(dǎo)的肝臟纖維化中的表達(dá)及沉默USP22基因?qū)θ烁涡菭罴?xì)胞(Human hepatic stellate cell-LX2，H

2、SC-LX2)周期蛋白的影響。
　　方法：
　　1.18只C57BL/6小鼠隨機(jī)分成3組：正常對照組（Con，喂養(yǎng)國家標(biāo)準(zhǔn)鼠飼料）、2％高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)1周組、2%高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)2周組；
　　2.分別檢測每組中小鼠血漿中同型半胱氨酸（Homocysteine,HCY）的含量，選取2%高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)2周組作為模型組（Model），Con組和Model組的肝臟組織采用HE、Massion染色，Western blot檢

3、測肝臟組織中膠原蛋白I、USP22的蛋白表達(dá)，免疫組化檢測膠原蛋白I、USP22的表達(dá)情況；
　　3.在體外實驗中，培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞LX2，用不同劑量的同型半胱氨酸（0,6μmol/L,12μmol/L,24μmol/L,48μmol/L）處理，且分別作用不同時間（0h,12h,24h,48h,72h）；
　　4.Western blot檢測不同劑量，不同濃度Hcy刺激下的人肝星狀細(xì)胞LX2（human hepatic st

4、ellate cell-LX2，HSC-LX2）膠原蛋白I、USP22的表達(dá)情況，選取Hcy刺激下的最佳作用時間和最佳作用濃度；
　　5.轉(zhuǎn)染分組：正常對照組（未予處理的人肝星狀細(xì)胞）、Hcy刺激組（最佳濃度，最佳時間刺激下的人肝星狀細(xì)胞）、siRNA組（siRNA USP22沉默Hcy刺激組），siNC組（siRNA NC沉默Hcy刺激組）；
　　6.Western blot檢測各組中膠原蛋白I（Collagen I，CO

5、LI）、USP22、P53、P27、P21、CyclinB1蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果：發(fā)現(xiàn)高蛋氨酸飼料喂養(yǎng)的小鼠和正常飼料喂養(yǎng)的小鼠相比，血漿中同型半胱氨酸的水平升高了，小鼠肝臟組織中膠原蛋白I、泛素水解酶22基因呈高表達(dá)狀態(tài)。在體外培養(yǎng)的人肝星狀細(xì)胞中，同型半胱氨酸刺激后，膠原蛋白I、USP22的表達(dá)呈劑量和時間依賴性，且敲除USP22基因后，可誘導(dǎo)其凋亡，并導(dǎo)致細(xì)胞周期被阻滯在G2期以內(nèi)。
　　結(jié)論：
　　1.2%高蛋氨酸飼