具有抗凝血活性的抗人組織因子單克隆抗體制備及特性分析.pdf

1、人組織因子（hTF）又稱(chēng)凝血因子III，由263個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成的相對(duì)分子量為47KD的單鏈跨膜糖蛋白，是維持人體止血平衡和健康的重要因子，但是在一些病理狀態(tài)下，hTF異常表達(dá)導(dǎo)致血管內(nèi)凝血、血管閉塞及血栓性疾病等。血栓形成和血栓栓塞兩種病理過(guò)程所引起的疾病，臨床上稱(chēng)為血栓性疾病，是現(xiàn)代生命醫(yī)學(xué)的研究焦點(diǎn)和熱點(diǎn)之一，因?yàn)槠浒l(fā)病率高居各類(lèi)疾病之首，已經(jīng)嚴(yán)重威脅到人類(lèi)的生命健康，且近年來(lái)還有漸增之勢(shì)。
　　隨著科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步，針對(duì)抗凝

2、藥物和抗血栓藥物的研究已取得長(zhǎng)足的進(jìn)步，但由于抗凝效果不佳或者藥物的特異性差在治療過(guò)程中容易引起出血、再狹窄等并發(fā)癥。而抗體藥物具有低毒、靶向性強(qiáng)和高效性的特點(diǎn)，國(guó)內(nèi)外雖有針對(duì)TF單克隆抗體的研究報(bào)道，但所得抗體多數(shù)抗凝效果不穩(wěn)定或特異性差，臨床開(kāi)發(fā)價(jià)值不大，因此研究以TF為靶點(diǎn)的具有高親和力、活性穩(wěn)定、特異性好的單克隆抗體(mAb)以阻斷hTF的促凝活性作為主要研究方向。
　　本文在實(shí)驗(yàn)室前期研究的基礎(chǔ)上，通過(guò)經(jīng)典雜交瘤技術(shù)，選

3、擇截?cái)嘈椭亟M組織因子（hTF243，具有完全抗凝血活性）作為抗原免疫BALB/c小鼠，利用間接酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）和血漿凝血酶原時(shí)間測(cè)定（PT）的方法，通過(guò)實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化篩選出了一株雜交瘤細(xì)胞株，能夠分泌具有良好抗凝血活性的mAb，而且通過(guò)小鼠腹水制備和蛋白質(zhì)A親和層析柱分離純化獲得了高純度的抗人重組組織因子mAb。通過(guò)聚丙烯酰胺凝膠電泳
　　1、通過(guò)經(jīng)典雜交瘤技術(shù)成功獲得了一株能夠分泌具有良好抗凝血活性的抗人組織因子單克隆

4、抗體雜交瘤細(xì)胞株，命名為mAb-TF-2。通過(guò)亞型鑒定試劑盒確定了該mAb屬于IgG1亞型，PT檢測(cè)結(jié)果顯示mAb可以抑制hTF243的凝血活性，延長(zhǎng)PT檢測(cè)時(shí)間。
　　2、通過(guò)腹水制備獲得了高效價(jià)的mAb。首先，經(jīng)SDS-PAGE分析，在55KD 和25KD處分別有一條明顯的條帶，正是抗體的重鏈與輕鏈；其次，通過(guò)間接ELISA測(cè)定腹水純化后抗體的效價(jià)為1:106；然后使用Western Blot鑒定，所得的抗體可以特異

5、性地識(shí)別hTF243蛋白，PT檢測(cè)結(jié)果表明腹水制備的mAb可有效的抑制hTF243的凝血活性，顯著延長(zhǎng)PT時(shí)間。
　　3、通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：結(jié)腸癌細(xì)胞（SW620）表面TF通過(guò)PT檢測(cè)顯示其具有良好的凝血活性，當(dāng)加入不同濃度的mAb時(shí)，其凝血時(shí)間逐漸延長(zhǎng)。
　　本論文完成后為進(jìn)一步研究以hTF為靶點(diǎn)的抗凝血藥物的臨床研究奠定基礎(chǔ)，也為進(jìn)一步研究hTF在人體凝血中的關(guān)鍵作用打下扎實(shí)的基礎(chǔ)，同時(shí)也為今后的研究工作提供科學(xué)