RNA干擾對P815細(xì)胞中PARs表達(dá)的影響的研究.pdf

1、蛋白酶激活受體(protease/proteinase-activated receptors, PARs)屬于與 G蛋白相偶聯(lián)、有七個跨膜單位的受體家族[1],目前在人和小鼠中共發(fā)現(xiàn)4種 PARs,分別為PAR-1、PAR-2、PAR-3和PAR-4。其中PAR-1, PAR-3和PAR-4是凝血酶受體[2,3,4],PAR-1, PAR-2和PAR-4是胰蛋白酶受體,PAR-2是類胰蛋白酶受體。
　　RNA干擾(RNA int

2、erference,RNAi)是是指細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性雙鏈RNA(double stranded RNA,dsRNA)或?qū)胪庠葱詃sRNA后,與dsRNA同源的內(nèi)源性mRNA發(fā)生特異性的降解,從而導(dǎo)致基因表達(dá)沉默的現(xiàn)象。因這種現(xiàn)象發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平,故又稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默(post-transcriptional gene silencing, PTGS)[5]。這種RNA水平上的基因抑制,提供了一種特異性失活功能基因的方法,成為基因表達(dá)調(diào)

3、控和功能基因組學(xué)研究的一個重要手段。本研究通過RNA干擾技術(shù),抑制PAR-1、PAR-2和PAR-4基因的表達(dá),并探討了PARs基因與IL-4、IL-6和IL-13分泌的影響。
　　分別合成了含有21個核苷酸PAR-1, PAR-2和PAR-4的的小雙鏈干擾RNA(siRNA),每種基因合成3對siRNA(siRNA PAR1-1、siRNA PAR1-2和siRNA PAR1-3;siRNA PAR2-1、siRNA PAR2-

4、2和siRNA PAR2-3;siRNA PAR4-1、siRNA PAR4-2和siRNA PAR4-3)。利用RNA干擾技術(shù),將以上9種siRNA分別導(dǎo)入P815細(xì)胞中。通過實時定量PCR、Western Blot免疫印記檢測技術(shù)、流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦技術(shù)在mRNA水平和蛋白水平分別檢測PAR-1, PAR-2和PAR-4表達(dá)情況;用PARs的激動肽、胰蛋白酶、類胰蛋白酶和凝血酶分別激發(fā)干擾了PAR-1、PAR-2和PAR-4表達(dá)

5、40小時后的P815細(xì)胞16小時,用ELISA檢測P815細(xì)胞細(xì)胞培養(yǎng)上清液中的IL-4、IL-6和IL-13。
　　實驗結(jié)果顯示:3種PAR-1的siRNA中,siRNA PAR1-1對目的基因無明顯抑制作用;PAR1-2在濃度為3nm,轉(zhuǎn)染48小時時的抑制效果最強,siRNA PAR1-3有較弱的抑制作用;3種PAR-2的siRNA中,PAR2-1、PAR2-2、PAR2-3對目的基因均有一定的抑制作,其中siRNA PAR2

6、-3對PAR2的抑制作用最強,其次為siRNA PAR2-2;3種PAR-4的siRNA中,siRNA PAR4-3在轉(zhuǎn)染不同的時間對PAR4均有較穩(wěn)定的抑制作用,其中在轉(zhuǎn)染48小時時,對PAR4的抑制作用最強,且較低濃度的siRNA抑制作用更強。siRNA PAR4-1和PAR4-2對目的基因的抑制作用較弱。
　　PAR-2和PAR-4不直接參與IL-4、IL-6和IL-13的釋放;PAR-1也不參與 IL-4和IL-13的釋放

7、;PAR-1被抑制時,IL-6的釋放量增加,暗示存在某種途徑可以通過PAR-1來抑制IL-6的釋放。
　　在mRNA水平上沉默PAR-1、PAR-2和PAR-4的表達(dá)后,胰蛋白酶和類胰蛋白酶將不再能促進(jìn)IL-4的分泌,說明胰蛋白酶和類胰蛋白酶對肥大細(xì)胞P815的作用極可能通過激活PARs實現(xiàn)。而凝血酶對肥大細(xì)胞P815的作用有可能是通過激活PAR-1和PAR-4實現(xiàn)的。當(dāng)P815細(xì)胞中的PAR-1的表達(dá)被抑制時,Il-6的釋放增加

8、,提示PAR-1可能通過某種途徑參與了IL-6的釋放。凝血酶、胰蛋白酶和類胰蛋白酶引起的IL-6的產(chǎn)生至少有部分途徑是通過PAR-1和PAR-2而起作用。PAR-4參與了這些絲氨酸蛋白酶引起的IL-6的釋放,并且這種作用具有放大效應(yīng),故當(dāng)PAR-4被抑制時,P815細(xì)胞的IL-6的釋放與對照相比會明顯減少。在mRNA水平上沉默PAR-1、PAR-2和PAR-4的表達(dá)后,PAR-AP、凝血酶、胰蛋白酶和類胰蛋白酶將不再能促進(jìn)P815細(xì)胞內(nèi)