塵螨抗原對P815肥大細(xì)胞Toll樣受體4及維生素D受體的直接作用研究.pdf

1、目的:
　　(1)觀察Toll樣受體4(Toll-like receptor4，TLR4)及維生素D受體(VitaminD Receptor, VDR)在小鼠肥大細(xì)胞P815的表達情況。
　　(2)觀察屋塵螨抗原(Dermatophagoides pteronyssinus，Der p)對P815細(xì)胞TLR4、VDR的表達及白細(xì)胞介素-4(Interleukin-4，IL-4)、白細(xì)胞介素-10（Interleukin-10

2、，IL-10）分泌的影響，探討Der p是否可以通過TLR4對肥大細(xì)胞產(chǎn)生作用。
　　(3)觀察1，25(OH)2D3對Der p直接作用的P815細(xì)胞TLR4、VDR的表達及IL-4、IL-10分泌的影響，探討1，25(OH)2D3在肥大細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)中的作用。
　　方法:
　　(1)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR)法及免

3、疫熒光(Immunofluorescence，IF)法檢測P815細(xì)胞TLR4及VDR的表達情況;
　　(2)將P815細(xì)胞接種至6孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h，分別給予不同濃度Derp(0，0.0001，0.001，0.01，0.1μg/ml)培養(yǎng)不同時間(2h，6h，12h，24h，36h)，實時熒光定量PCR(Real-time polymerase chain reaction，Real-time PCR)法檢測各組細(xì)胞TL

4、R4 mRNA及VDR mRNA的表達變化，并確定Der p的最適作用濃度及作用時間;免疫印跡(Western Blotting，WB)法檢測0.1μg/ml Der p作用于肥大細(xì)胞36h后TLR4及VDR的蛋白表達變化。
　　(3)將P815細(xì)胞接種至6孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h，分為4組:空白對照組（Ⅰ組），1，25(OH)2D310-12M組（Ⅱ組），1，25(OH)2D310-10M組（Ⅲ組），1，25(OH)2D310

5、-8M組（Ⅳ組），培養(yǎng)36h后，Real-time PCR法檢測各組細(xì)胞TLR4mRNA及VDR mRNA的表達變化，WB法檢測TLR4及VDR的蛋白表達變化，酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測各組細(xì)胞懸液上清中IL-4、IL-10的表達情況。
　　(4)將P815細(xì)胞接種至6孔平底細(xì)胞培養(yǎng)板培養(yǎng)24h，分為5組:空白對照組（a組），Derp0.1μg/ml組（

6、b組），Der p0.1μg/ml+1，25(OH)2D310-12M組(c組), Der p0.1μg/ml+1,25(OH)2D310-10M組（d組）,Der p0.1μg/ml+1,25(OH)2D310-8M組（e組），培養(yǎng)36h后，Real-time PCR法檢測各組細(xì)胞TLR4 mRNA及VDR mRNA的表達變化，WB法檢測TLR4及VDR的蛋白表達變化，ELISA法檢測各組細(xì)胞懸液上清中IL-4、IL-10的表達情況。

7、
　　結(jié)果:
　　(1) P815細(xì)胞上TLR4及VDR的表達情況:RT PCR及IF均顯示TLR4、VDR在P815細(xì)胞上有表達。
　　(2)不同濃度Der p處理P815細(xì)胞不同時間后TLR4 mRNA及VDR mRNA表達結(jié)果:Der p濃度為0.0001μg/ml時，作用不同時間點P815細(xì)胞TLR4 mRNA表達均無明顯變化(P＞0.05)，而0.001μg/ml，0.01μg/ml，0.1μg/ml的Der

8、 p均可上調(diào)P815細(xì)胞TLR4 mRNA的表達，但沒有明顯時間依賴性。在作用36h組，C、D、E組TLR4 mRNA表達顯著高于A組（P＜0.05或P＜0.01），且呈濃度依賴性上調(diào)。Der p濃度為0.0001μg/ml時，作用2，6，12，24h后P815細(xì)胞VDR mRNA的表達均無明顯變化(P＞0.05)，但作用36h后VDR mRNA表達明顯下降(P＜0.05); Der p濃度在0.001μg/ml時，作用2，6h后VDR

9、 mRNA的表達無明顯變化(P＞0.05)，但在作用12，24，36h后，P815細(xì)胞VDR mRNA表達明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）;在0.01μg/ml，0.1μg/ml濃度下作用各時間點VDR mRNA表達均顯著下降（P＜0.05或P＜0.01），但相同濃度條件下VDR mRNA表達減少無明顯時間依賴性。在12h和24h作用組，VDR mRNA表達呈濃度依賴性下降。
　　(3)不同濃度Der p處理P815細(xì)胞36

10、h后TLR4和VDR蛋白表達結(jié)果:B、C、D、E組TLR4蛋白表達均顯著高于A組(P＜0.05或P＜0.01)，且TLR4蛋白表達呈濃度依賴性上調(diào);B組VDR蛋白表達與A組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，C、D、E組VDR蛋白表達均顯著低于A組(P＜0.05或P＜0.01)，且呈濃度依賴性下降。
　　(4)不同濃度1，25(OH)2D3處理P815細(xì)胞36h后TLR4和VDR mRNA和蛋白表達結(jié)果:Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組TLR4 m

11、RNA及蛋白表達與Ⅰ組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);Ⅱ、Ⅲ組VDR mRNA表達與Ⅰ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Ⅳ組VDR mRNA表達顯著高于Ⅰ組(P＜0.05)，Ⅱ組VDR蛋白表達與Ⅰ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Ⅲ、Ⅳ組VDR蛋白表達顯著高于Ⅰ組(P＜0.05或P＜0.01)。
　　(5) Der p、1，25(OH)2D3聯(lián)合處理P815細(xì)胞36h后TLR4和VDR mRNA和蛋白表達的變化

12、:與a組比較，b組TLR4 mRNA及蛋白表達明顯升高(P＜0.01及P＜0.05)，VDR mRNA及蛋白表達明顯下降（P＜0.01及P＜0.05）;與b組比較，c、d組TLR4 mRNA表達無明顯變化(P＞0.05)，e組TLR4 mRNA表達明顯升高(P＜0.01)，c、d、e組VDR mRNA表達明顯升高(P＜0.05)，c組TLR4和VDR蛋白表達均無明顯變化(P＞0.05)，d、e組TLR4蛋白表達顯著升高(P＜0.05)，

13、VDR蛋白表達顯著升高(P＜0.01)。
　　(6)不同濃度1，25(OH)2D3處理P815細(xì)胞36h后上清中IL-4、IL-10濃度的變化:Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組上清中IL-4濃度與Ⅰ組比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Ⅱ組上清中IL-10濃度與Ⅰ組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Ⅲ、Ⅳ組上清中IL-10濃度與Ⅰ組比較顯著升高(P＜0.01)。
　　(7) Der p、1，25(OH)2D3聯(lián)合處理P815細(xì)胞36h后

14、上清中IL-4、IL-10濃度的變化:與a組比較，b組上清中IL-4濃度顯著升高(P＜0.01)，IL-10濃度無明顯變化(P＞0.05);與b組比較，c、d、e組上清中IL-4濃度顯著下降(P＜0.05或P＜0.01)，且1，25(OH)2D3濃度越高，IL-4下降越明顯，而IL-10濃度無明顯變化(P＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　(1)塵螨抗原可通過上調(diào)肥大細(xì)胞上TLR4表達，下調(diào)VDR表達，使IL-4分泌增加，從而促