雷洛昔芬對鎘染毒大鼠成骨細胞維生素D受體的影響.pdf

1、目的：通過體外培養(yǎng)大鼠成骨細胞及建立鎘染毒細胞模型，觀察染鎘及雷洛昔芬干預后成骨細胞的存活率以及雌激素受體α(Estrogen receptorα，ERα)和維生素D受體(vitamin Dreceptor，VDR)在細胞中的表達，探討雷洛昔芬(raloxifene，RAL)對鎘染毒成骨細胞(osteoblast，OB)的作用及機制，為臨床治療慢性鎘中毒所致骨損害提供新的方法。
　　方法：選取出生不足24h的新生大鼠5只，通過胰酶

2、和Ⅰ型膠原酶消化，從顱項骨中分離提取出成骨細胞，對所提取的成骨細胞進行細胞形態(tài)學鑒定。進行細胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)。所有實驗檢測均選用第4代細胞。用CCK-8法檢測不同濃度鎘染毒和雷洛昔芬干預后各組成骨細胞的存活率，選取適宜的鎘和雷洛昔芬濃度進行后續(xù)實驗。將成骨細胞分為對照組，氯化鎘組及雷洛昔芬組。用Trizol法提取各組成骨細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，RT-PCR技術擴增出目的片段，測定各組成骨細胞中ERα和VDR基因表達情況;提取

3、細胞總蛋白，通過蛋白質印跡法檢測鎘染毒后以及雷洛昔芬干預后成骨細胞中VDR蛋白的表達情況。實驗數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結果：原代成骨細胞貼壁前呈均勻球形，約24h開始貼壁，48～96h完全貼壁，細胞呈長梭形或多角形，與其他文獻報道一致;對照組成骨細胞形態(tài)正常，與培養(yǎng)皿底貼合緊密;氯化鎘組細胞形態(tài)發(fā)生改變，與培養(yǎng)皿底貼合不緊密，約50％細胞死亡;與氯化鎘組相比，雷洛昔芬

4、組少數(shù)細胞發(fā)生形態(tài)改變，與培養(yǎng)皿底貼合較為緊密，約20％細胞死亡。CCK-8實驗顯示:與對照組相比，氯化鎘組細胞活力明顯下降(P＜0.01)，細胞存活率與鎘濃度呈反比(24h:r=-0.956, P＜0.01;48h: r=-0.992, P＜0.01),1μmol/LCdCl2作用24h即可使成骨細胞存活率由100.00％下降至85.49％，8μmol/L CdCl2作用24h后，成骨細胞存活率下降至50.22％;與氯化鎘組相比，雷洛

5、昔芬組成骨細胞活力顯著增加(P＜0.01)，細胞存活率與雷洛昔芬濃度呈正比(24h: r=0.877，P＜0.01;48h:r=0.965，P＜0.01)，1mg/L RAL干預24h細胞存活率無明顯改變，而8mg/L RAL干預24h后細胞存活率可高達152.67％。RT-PCR顯示:與對照組相比，氯化鎘組成骨細胞內(nèi)ERα表達上調(P＜0.05)，VDR基因表達明顯下降(P＜0.05);而與氯化鎘組相比，雷洛昔芬組成骨細胞內(nèi)ERα表達

6、下降(P＜0.05)，VDR基因表達顯著增高(P＜0.05)。蛋白印跡結果顯示:與對照組相比，氯化鎘組成骨細胞內(nèi)VDR蛋白表達明顯下降(P＜0.05);與氯化鎘組相比，雷洛昔芬組成骨細胞內(nèi)VDR蛋白表達顯著增高(P＜0.05)，結果與RT-PCR一致。
　　結論：鎘可以通過其類雌激素作用對成骨細胞產(chǎn)生直接毒性，其機制可能是通過與ERα結合下調成骨細胞內(nèi)VDR的表達;而雷洛昔芬可以干預鎘的類雌激素作用，通過拮抗鎘下調成骨細胞內(nèi)VDR