Der p、CpG ODN及LPS作用P815肥大細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)機(jī)制研究.pdf

1、目的:
　　1.觀察塵螨抗原(Der p)對P815細(xì)胞Toll樣受體9(TLR9)、TLR4及其下游通路胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)的作用，以及對白介素4(IL-4)、IL-13、IL-10、胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素(TSLP)分泌的影響，探討Der p對肥大細(xì)胞(MCs)的直接作用及其作用機(jī)理。
　　2.觀察CpG寡聚脫氧核苷酸(CpG ODN)及脂多糖(LPS)對Der p直接作用P81

2、5細(xì)胞后TLR4、TLR9、ERK1/2、PI3K表達(dá)及IL-4、IL-10分泌的影響，探討CpG ODN及LPS對MCs的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制。
　　方法:
　　1.塵螨抗原直接作用P815細(xì)胞:將P815細(xì)胞接種至6cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)24h培養(yǎng)后改用無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5h，根據(jù)塵螨抗原濃度不同分成空白對照組（a組）、Der p0.001μg/ml(b組)、Der p0.01μg/ml(c組)、Der p0.1μg/ml(d組)

3、，分別培養(yǎng)12h及24h。免疫印跡(WB)法檢測各組TLR9蛋白表達(dá)及ERK1/2磷酸化水平1。酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測12h后各組細(xì)胞懸液上清液中IL-4、IL-10、IL-13及TSLP的表達(dá)情況。
　　2.CpG ODN、LPS單獨或聯(lián)合塵螨抗原直接作用P815細(xì)胞:將P815細(xì)胞接種至6cm培養(yǎng)皿中，經(jīng)24h培養(yǎng)后改用無血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)5h，分成6組:空白對照組（A組），Der p0.01μg/ml組（B組），

4、CpG ODN0.5μg/ml(C組),Der p0.01μg/ml+CpG ODN0.5μg/ml(D組),LPS10μg/ml(E組)，Der p0.01μg/ml+LPS10μg/ml(F組)，培養(yǎng)12h后，WB法檢測TLR9、TLR4的蛋白表達(dá)及ERK1/2與PI3K的磷酸化水平2，ELISA法檢測各組細(xì)胞上清液中IL-10、IL-4的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.塵螨抗原直接作用P815細(xì)胞
　　1.1不同

5、濃度Derp作用P815細(xì)胞12h及24h后TLR9的蛋白表達(dá)變化
　　不同濃度Der p(0μg/ml、0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml)直接作用P815細(xì)胞12h及24h后
　　WB結(jié)果示:與空白對照組比較，Der p作用12h后，0.01μg/ml組和0.1μg/ml組細(xì)胞TLR9蛋白表達(dá)顯著下降（P均＜0.01），0.001μg/ml組表達(dá)無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）;與空白對照組比較，De

6、r p作用24h后，0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.1μg/ml組TLR9蛋白表達(dá)均顯著下降（P均＜0.01），組間無明顯濃度依賴性;相同濃度下，作用24h組比作用12h組的TLR9蛋白表達(dá)顯著降低（P均＜0.01）。
　　1.2不同濃度Der p作用P815細(xì)胞12h及24h后通路ERK1/2的磷酸化水平變化
　　WB結(jié)果示:與空白對照組比較，Der p作用12h后，0.01μg/ml組和0.1μg/ml組細(xì)

7、胞ERK1/2蛋白磷酸化水平均顯著升高(p＜0.05或p＜0.01)，0.001μg/ml組無顯著改變(P＞0.05);與空白對照組比較，Der p作用24h后，0.001μg/ml、0.01μg/ml和0.1μμg/ml組細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化水平均顯著升高(p均＜0.01），組間無明顯濃度依賴性;當(dāng)Der p濃度同為0.001μg/ml或0.01μg/ml時，作用24h組比作用12h組細(xì)胞ERK1/2蛋白磷酸化水平顯著升高（P均

8、＜0.01）。
　　1.3不同濃度Der p作用P815細(xì)胞12h后上清中IL-4、IL-10、IL-13及TSLP的釋放水平。
　　ELISA結(jié)果示:與空白對照組比較，0.001 g/ml組和0.01μg/ml組上清中IL-4表達(dá)顯著升高(p＜0.05或p＜0.01)，IL-10則顯著降低(p＜0.05或p＜0.01)，但0.1μg/ml組IL-4及IL-10均無顯著改變(p＞0.05），而0.001μg/ml、0.01μ

9、g/ml及0.1μg/ml組上清中IL-13及TSLP表達(dá)均顯著升高(p＜0.05），且IL-13各組間呈濃度依賴性，TSLP無明顯濃度依賴性。
　　2.CpG ODN、LPS對塵螨抗原直接作用P815細(xì)胞的干預(yù)和影響
　　分成6組，分別為空白對照組（A組），Der p0.01μg/ml組（B組），CpG ODN0.5μg/ml(C組),Der p0.01μg/ml+CpG ODN0.5μg/ml(D組),LPS10μg/m

10、l(E組), Der p0.01μg/ml+LPS10μg/ml(F組)。
　　2.1 CpG ODN、LPS單獨或聯(lián)合Der p作用P815細(xì)胞12h后TLR9和TLR4的蛋白表達(dá)變化
　　WB結(jié)果示:與空白對照組比較，B組TLR9蛋白表達(dá)顯著下降(p＜0.01)，TLR4蛋白表達(dá)無顯著變化(p＞0.05)，C組TLR9蛋白表達(dá)顯著升高(p＜0.05），TLR4蛋白表達(dá)顯著下降(p＜0.05），E組TLR9、TLR4蛋白表

11、達(dá)均無顯著改變(p均＞0.05）;與B組比較，D組TLR9蛋白表達(dá)顯著升高(p＜0.01)，但TLR4蛋白表達(dá)無顯著變化(p＞0.05），F(xiàn)組TLR9、TLR4蛋白表達(dá)均無顯著差異(p均＞0.05）。
　　2.2 CpG ODN、LPS單獨或聯(lián)合Der p作用P815細(xì)胞12h后通路ERK1/2和PI3K的磷酸化水平變化
　　WB結(jié)果示:與空白對照組比較，B、E、F組ERK1/2與PI3K磷酸化水平均顯著升高(p均＜0.01

12、），C、D組ERK1/2磷酸化水平無顯著改變(p均＞0.05)，但D組PI3K磷酸化水平顯著升高(p＜0.01);與B組比，D組ERK1/2磷酸化水平顯著降低(p＜0.01)，F(xiàn)組ERK1/2磷酸化水平顯著升高(p＜0.01），但D、F組PI3K磷酸化水平無顯著差異(p均＞0.05）。
　　2.3 CpG ODN、LPS單獨或聯(lián)合Der p作用P815細(xì)胞12h后上清中IL-4及IL-10的釋放水平
　　ELISA結(jié)果示:與

13、空白對照組比較，B、E組細(xì)胞上清液中IL-4表達(dá)顯著升高(P＜0.05或P＜0.01)，而IL-10表達(dá)顯著下降(p均＜0.05），C組IL-4表達(dá)顯著下降(p＜0.05），但I(xiàn)L-10表達(dá)無顯著改變（p＞0.05）;和B組相比，D組與F組表達(dá)無論IL-4還是IL-10的表達(dá)均無顯著差異(p均＞0.05)。
　　結(jié)論:
　　1.塵螨抗原可經(jīng)非IgE介導(dǎo)途徑直接激活P815細(xì)胞，下調(diào)TLR9蛋白表達(dá)，并能通過ERK1/2和PI

14、3K信號通路的活化，引起IL-4、IL-13、TSLP分泌增加，IL-10分泌減少，從而促進(jìn)炎癥及過敏反應(yīng)的發(fā)生與發(fā)展，但對TLR4的影響不大。
　　2.LPS可經(jīng)ERK1/2及PI3K信號通路引起P815細(xì)胞IL-4分泌增加，IL-10分泌減少，從而誘發(fā)炎癥反應(yīng)。
　　3.LPS可增加塵螨抗原引起的肥大細(xì)胞ERK1/2信號通路活化，但對TLR9、TLR4受體的變化及IL-4、IL-10的分泌并無顯著影響。
　　4.C