肥大細胞吸收角叉菜膠

1、,第十章 抗炎藥物研究,,,第一節(jié) 炎癥概述,炎癥（inflammation）是常見又十分重要的病理過程，如肝炎、肺炎、腎炎、關節(jié)炎、癤等。,癤：毛囊、皮脂腺及其周圍組織的膿腫,,甲型肝炎：皮膚 呈黃褐色，鞏膜 黃染,皮膚燒傷,,上述疾病是由不同原因引起的炎癥性病變。什么是炎癥？炎癥病變有何特點？炎癥的意義和作用？將對這些問題進行討論。,何謂炎癥？,炎癥的定義 炎癥(inflammation)是具

2、有血管的機體組織對致炎因子造成的損傷所作出的防御性反應。,,致炎因子為能引起機體組織損傷而誘發(fā)炎癥因素。,何謂致炎因子？,,包括： 病原生物因子：如細菌、病毒等，是最常見致 炎因子，通過釋放毒素直接導致細胞和組 織損傷導致炎癥，而且還通過其抗原性誘 發(fā)超敏反應導致炎癥。 化學損

3、傷，物理損傷因子：高溫、強酸、強 堿等引起炎癥。 免疫反應：變態(tài)反應可引起變態(tài)反應性炎癥， 如關節(jié)炎。,,病原生物因子：化膿性腦膜炎，腦膜炎雙球菌引起組織壞死和膿液形成,炎癥是致炎因子引起的機體防御反應，其作用在于殺滅微生物，

4、清除異物，防止損傷擴大，促進損傷修復。,,炎癥有何意義和作用？,第二節(jié) 炎癥局部的基本病理變化,任何炎癥，不論其原因、發(fā)生部位如何，炎癥的局部都有著共同的病理變化——變質(zhì)、滲出、增生。 但是不同的炎癥或炎癥的不同階段，三者的變化程度和組合方式不同。有的炎癥以變質(zhì)性改變?yōu)橹?，有的以滲出性改變?yōu)橹?，有的以增生性改變?yōu)橹?，有時也可互相轉(zhuǎn)化。,急性炎癥病程在幾天~1個月內(nèi)。起病急，發(fā)展快，病變特點以變質(zhì)、滲出改變?yōu)橹鳎?/p>

5、浸潤的炎細胞主要為中性白細胞。 慢性炎癥病程在幾個月~幾年以上。起病與病變發(fā)展均緩慢，臨床癥狀與體征均不明顯。病變以增生改變?yōu)橹鳌?變質(zhì)屬于損害作用，而滲出、增生屬于抗損害作用。,一. 變質(zhì)alteration,炎癥局部組織細胞所出現(xiàn)的變性、壞死改變，統(tǒng)稱為變質(zhì)。,,,細胞水腫脂肪變性壞死,變質(zhì)表現(xiàn): 例如,,二. 滲出exudation,炎癥灶內(nèi)血管中的血液成分（液體和細胞）通過血管壁進入周圍組織內(nèi)的過程，稱為滲出。,

6、滲出的液體成分稱為滲出液；細胞成分稱為炎細胞；兩者合稱滲出物。,液體滲出（滲出液—炎癥時滲出的液體統(tǒng)稱） 原因：（1）毛細血管壁通透性升高,血漿蛋 白滲出 （2）組織膠滲壓升高，血漿膠滲壓 液體降低,液體易滲出。,病理變化：炎性水腫—液體滲出到組織間隙積聚,炎 性 水 腫按一下

7、有凹陷,組織液生成示意圖,,,,,,,,,炎性水腫發(fā)生主要機制: 炎癥介質(zhì)作用下，微血管壁通透性升高,富含蛋白質(zhì)的滲出液的產(chǎn)生主要是由血管通透性增加造成的。,炎癥 微血管壁通透性↑ 血漿蛋白滲出↑ 細胞間隙膠體滲透壓↑ 和 血漿膠體滲透壓↓ 有效濾過壓↑ cap內(nèi)水

8、分濾出↑ 水腫,,,,,,,滲出液有何意義?,滲出液可稀釋及帶走炎癥灶內(nèi)的毒素、毒性產(chǎn)物，從而可以減輕組織損傷。,滲出液中含有抗體、補體及溶菌酶，有利于消滅病原體。,滲出的纖維蛋白原可轉(zhuǎn)化為纖維蛋白并可交織成纖維蛋白網(wǎng)，可阻止病菌的播散，并有利于吞噬細胞的吞噬作用。,具有重要的防御作用,,滲出液對機體的不利影響：,過多的纖維蛋白滲出而不能完全吸收時，則可引起器官的粘連（如心包粘連）,滲出液過多可壓迫

9、周圍組織臟器而引起相應嚴重后果：如心包積液，壓迫心臟;,心包積液，壓迫心臟,心包粘連 過多的纖維蛋白滲出而不能完全吸收時，造成組織的粘連和硬化。,細胞滲出-----主要為各種白細胞滲出 血液內(nèi)各種白細胞經(jīng)血管壁滲出到血管外的現(xiàn)象稱為白細胞滲出。白細胞聚集于炎癥局部組織間隙內(nèi)稱炎細胞浸潤。,,白細胞滲出的過程: 白細胞滲出的過程是一個主動運動的過程，包括白細胞邊集和黏附（附壁）、白細胞跨壁、白

10、細胞游出（見圖）。,,,,白細胞從血管內(nèi)游出到血管周圍后， 朝化學刺激物作定向的游走，稱為趨化作用。 此化學物稱趨化因子，包括可溶性細菌產(chǎn)物(細菌毒素)、補體系統(tǒng)成分（特別是C5a）和花生四烯酸經(jīng)脂氧酶途徑的代謝產(chǎn)物（特別是白細胞三烯B4） 等。,趨化作用(Chemotaxis),中性粒細胞：細胞核為分葉狀，細胞質(zhì)染成紅紫色。,單核細胞： 細胞核為馬鞍形，細胞質(zhì)染成蘭灰色。,,白細胞滲出有何意義

11、?,重要的防御作用----白細胞游走到炎癥區(qū)域后，可發(fā)揮吞噬和消化病原體及壞死組織碎片等異物的作用， 白細胞滲出是人體消除致炎因子的一種重要手段。,,三.增生,在致炎因素或組織崩解產(chǎn)物長期刺激下，炎癥灶內(nèi)組織細胞、巨噬細胞、血管內(nèi)皮細胞及成纖維細胞的增生。,增生改變在炎癥早期或急性炎癥時多 不明顯，但到炎癥后期尤其是慢性炎 癥時，則成為突出的改變。增生是慢性炎癥的特征性改變。,炎性增生是一種防御

12、性反應，增生的成纖維細胞和血管內(nèi)皮細胞有助于炎癥局限化及損傷組織的修復。,,炎性增生有何意義?,第三節(jié) 炎癥的臨床表現(xiàn),局部表現(xiàn):紅腫熱痛功能障礙全身反應：發(fā)熱外周血白細胞增多:單核巨噬細胞系統(tǒng)增生,紅---炎性充血引起 。初期為動脈性充血引起 ， 以后可轉(zhuǎn)為靜脈性充血。腫---炎性水腫引起。熱---炎癥早期炎性充血引起。痛---炎癥介質(zhì)前列腺素和緩激肽對神經(jīng)末梢的

13、 刺激引起疼痛； 滲出物造成組織腫脹，壓迫神經(jīng)末梢引起 疼痛。功能障礙--炎癥灶內(nèi)細胞變性、壞死、代謝功能異常，炎性滲出物造成的機械性阻塞、壓迫等，都可能引起發(fā)炎器官的功能障礙。,發(fā)熱: 一定程度的體溫升高可增強肝臟解毒功能，促進抗體形成，增強吞噬細胞的吞噬作用。但若出現(xiàn)持續(xù)性高熱或出現(xiàn)超高熱，病人的各實質(zhì)臟器尤其是腦神經(jīng)細胞可發(fā)生變性壞死。,全身反應：,,,,外周血白細胞增多:急性炎

14、癥，尤其是細菌感染所致急性炎癥時，白細胞計數(shù)可明顯升高。這是由于IL-1和TNF等刺激骨髓中白細胞儲存庫釋放加速。白細胞數(shù)的增多也是機體防御機能的一種表現(xiàn)。,單核巨噬細胞系統(tǒng)增生: 機體防御反應的表現(xiàn)，肝、脾及淋巴結腫大，巨噬細胞增生以增強對病原體的吞噬。,第四節(jié) 炎癥介質(zhì) 一.炎癥介質(zhì) 1.炎癥介質(zhì)概念（inflammatory mediators） 炎癥介質(zhì)是一類參與炎癥反應并具有致炎作用的信息

15、分子。他們介導了炎癥的發(fā)生，發(fā)展。,炎癥介質(zhì)：,外源性炎癥介質(zhì)：細菌及其產(chǎn)物。內(nèi)源性炎癥介質(zhì)：,主要作用：①擴張小血管②使小血管通透性增高③白細胞趨化作用④致熱致痛⑤致組織損傷,2． 細胞釋放的炎癥介質(zhì) ①  血管活性胺 包括組胺（histamine）和5-羥色胺（5-HT）。 肥大細胞、白細胞和血小板→釋放組胺→作用于組胺受體→血管擴張；血管通透性增高，滲出液

16、增多 血小板釋放5-HT→作用與組胺類似,,肥大細胞（mast cells）是一種重要的免疫細胞，與人類和動物的某些變態(tài)反應性疾病、炎癥等密切相關。 肥大細胞分布于血管附近，參與炎癥、過敏等生理、病理反應，分泌多種活性物質(zhì)和細胞因子。,肥大細胞(3.3×10) 大鼠皮下組織鋪片 甲苯胺蘭染色 肥大細胞分布于血管附近,肥大細胞(3.3×40) 細胞質(zhì)呈紫藍色，核淡染居中，胞質(zhì)內(nèi)充滿顆粒，可合成分

17、泌組胺和白三烯,肥大細胞以脫顆粒方式釋放組胺,肥大細胞電鏡照片,,②   花生四烯酸代謝產(chǎn)物首先看一下膜磷脂代謝路徑,在炎癥中，中性粒細胞的溶酶體是磷脂酶的重要來源。,細胞膜磷脂生成的物質(zhì)及其作用及抗炎藥的作用部位示意圖,花生四烯酸代謝產(chǎn)物 a.  前列腺素（大多數(shù)細胞能合成）—強烈的擴血管和使血管通透性增強作用，致熱，致痛作用。 b.  白細胞三烯（白三烯LTs）—白細胞和

18、肥大細胞合成，增高血管通透性，對白細胞趨化作用。,,③ 白細胞產(chǎn)物 氧自由基：主要由單核細胞產(chǎn)生，氧自由基可以與細胞膜上脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應，破壞細胞膜的穩(wěn)定性。 中性粒細胞溶酶體成分：因中性粒細胞的死亡，溶酶體成分可外釋，介導急性炎癥。其中含蛋白酶可導致組織損傷破壞。,④ 細胞因子 主要由激活的淋巴細胞、單核巨噬細胞產(chǎn)生白細胞介素（interleukin,IL 如IL-1 ）和腫瘤壞死因子（tumor nec

19、rotic factor,TNF） IL-1：促進纖維母細胞、內(nèi)皮細胞增生。促使白細胞粘附；具有致熱源作用。 TNF :趨化和激活中性粒細胞；促進溶酶體釋放溶酶體酶，引起組織損傷。,主要炎癥介質(zhì)的作用,第五節(jié) 炎癥的分類與結局,炎癥的分類：(根據(jù)病程長短分類),急性炎癥 起病急，發(fā)展快，病變特點以變質(zhì)、滲出改變?yōu)橹鳌?慢性炎癥 起病與病變發(fā)展均緩慢。以增生改變?yōu)橹鳎橛酗@著纖維組織增生。,炎癥的結局：

20、 大多數(shù)急性炎癥能夠痊愈; 少數(shù)遷延為慢性炎癥; 極少數(shù)可蔓延擴散到全身。,,少數(shù)炎癥遷延為慢性炎癥,致炎因子不能在短期清除，在機體內(nèi)持續(xù)作用，不斷地損傷組織，造成炎癥遷延不愈，便使急性炎癥轉(zhuǎn)變成慢性炎癥，病情可時輕時重。 如老慢支：咳痰喘，長期存在。,極少數(shù)炎癥蔓延擴散,病人的抵抗力低下，或病原微生物毒力強、數(shù)量多的情況下，可不斷繁殖并直接向周圍組織、器官蔓延，或向全身擴散。,血行蔓延：

21、炎癥灶中的病原微生物可直接或通過淋巴路侵入血循環(huán)或病原微生物的毒素毒性產(chǎn)物吸收入血，引起以下表現(xiàn)：,細菌由局部病灶入血，無明顯全身中毒癥狀，但血液中可查到細菌。,細菌的毒性產(chǎn)物或毒素被吸收入血。 臨床癥狀,細菌由局部病灶入血后，大量繁殖，并產(chǎn)生毒素，引起全身中毒癥狀和病理變化。 臨床癥狀,毒力強的化膿菌引起的敗血癥進一步發(fā)展而成為膿毒敗血癥。 臨床癥狀,,,高熱和寒戰(zhàn)等全身中毒癥狀，伴有心、肝、腎等實質(zhì)細胞的變性或壞死

22、，嚴重時出現(xiàn)中毒性休克。血培養(yǎng)陰性。,毒血癥,,臨床有毒血癥的表現(xiàn)(寒顫、高熱、頭痛、脾、淋巴結腫大等)及皮膚和粘膜的多發(fā)性出血斑點。此時血液中?？膳囵B(yǎng)出病原菌-----血培養(yǎng)（+）。,敗血癥,,臨床上患者有敗血癥的表現(xiàn)。在肺、腎、肝等形成細菌栓塞性小膿腫。這些膿腫通常較小、較均勻散布在器官中。,膿毒血癥,腎栓塞性膿腫:膿腫較小、較均勻散布; 由含菌栓子栓塞引起，梗死灶內(nèi)有細菌感染。,,,第六節(jié) 抗炎藥物模型制備及實驗原理,一.

23、 概論 實驗性炎癥模型較多，主要針對炎癥過程發(fā)展的三個不同時期而設計的。 （1） 以血管通透性為主要改變的急性炎癥模型（以紅斑或水腫、滲出形成腫脹為主要指標）。 例如：角叉菜膠及白蛋白所造成的足跖腫脹法。,,（2） 以細胞游走為主要指標的白細胞趨化性炎癥模型。（3） 以組織增生為指標的慢性炎癥模型。 另外有免疫性的炎癥模型： 例如：大鼠佐劑性關節(jié)炎,動物的選擇（1

24、）足跖腫脹法采用大鼠為實驗動物。（2）篩選抗過敏性炎癥藥物應首選豚鼠。 (3) 因雌激素有抗炎作用，一般選擇雄性 動物。,,藥物劑量測定LD50以1/10~1/15LD50作為初篩。初篩動物一般選擇小鼠，或降低至體內(nèi)濃度，用離體器官組織初篩。如中藥制劑測不出LD50，則先用最大可能給予的藥量，如有效再減量，觀察量效關系。,給藥時間與途徑: (1)對于發(fā)展較快的急性炎癥模型采用預防給藥。于致炎前1~2小時（po）

25、或0.5~1小時前（ip、im）給藥 (2) 對發(fā)展較慢的慢性炎癥模型或變態(tài)反應性炎癥模型，宜實驗治療給藥或兩者結合進行。,觀察指標與療效判定（1） 紅斑模型。以“0、+、++、+++”等記錄來估計充血程度，主觀因素較強，較難做統(tǒng)計學分析。（2） 水腫模型。以腫脹度為指標：以容積法和足周徑測定法為常用測定腫脹度的方法。,療效判定 對照組平均腫脹度— 給藥組平均腫脹度抑制率= —

26、—————————————————×100% 對照組平均腫脹度 腫脹度，對照組與給藥組經(jīng)統(tǒng)計學處理 （一般為t檢驗） 有顯著性差異p＜0.05或p＜0.01,炎癥病理模型：急性炎癥模型 角叉菜膠或白蛋白致大鼠足跖腫脹法 二甲苯致小鼠鼠耳腫脹度法 大白鼠胸膜炎法 白細胞趨化性體內(nèi)實驗法

27、慢性炎癥模型 大鼠棉球植入法 （即肉芽腫模型） 大鼠巴豆油免疫法免疫性炎癥模型： 大鼠佐劑性關節(jié)炎 豚鼠免疫性胸膜炎,,,要確定一個藥物有無抗炎作用，宜采用多種炎癥模型，即急性炎癥模型2~3種，肉芽腫模型，免疫性炎癥模型一種，綜合結果，評定療效。,常用的抗炎實驗方法,1.大鼠足跖腫脹法 致炎劑: 短效致炎劑：白蛋白、5-HT、組織胺等30min炎癥腫脹達高峰，消失亦快。 中效致炎劑：角叉菜

28、膠、瓊脂、酵母60min炎癥腫脹達高峰。 這兩類致炎劑以角叉菜膠效果最好，優(yōu)點為腫脹模型可靠，差異性小，有高度的重現(xiàn)性。,,實驗原理： 第一階段：肥大細胞吸收角叉菜膠，脫顆粒釋放PGE，局部充血水腫，持續(xù)60min。 第二階段：受損的內(nèi)皮細胞釋放IL-1，使WBC移入，吞噬角叉菜膠，釋放磷脂酶A2和PGs，導致水腫滲出。,方法要點： 取雄性大鼠，設立給藥組、陰性及陽性對照組，致炎前

29、30 ~ 60min 給藥（ ig~30min ， ip~60min），在足跖腱膜下用1%角叉菜膠0.05ml致炎，測定給藥前、給藥后5min、30min、1h、2h、4h、6h足爪的周長或容積。,,觀察指標：以致炎前后周長或容積的差值為腫脹度，周長可由專門的熟練人員用軟皮尺測定，或測定容積則由專門的容積測定儀測定。,統(tǒng)計方法：計算給藥組與對照組腫脹度均值與標準差，各用藥組的抑制率。并進行組間t檢驗，比較給藥組與對照組的顯著性差異。

30、,,評價：①本法未應用最廣的炎性水腫模型，具有差異性小，敏感性和重現(xiàn)性高等優(yōu)點但特異性低，非抗炎藥也可能有效。②大鼠易得，勿需復雜儀器，簡便易行。,2.鼠耳腫脹法 將小鼠隨機分成各組，用二甲苯涂于左耳上，可發(fā)生炎癥反應，涂二甲苯后30min腹腔注射或灌胃給藥，4h后將小鼠處死，剪下兩耳，打孔器打下圓孔片，稱重。 每鼠左耳片重減去右耳片重即為腫脹度。 評價：新抗炎藥常規(guī)篩選方法，初篩。見效快，用藥量少，成功率較高，

31、成本較低。,3.大鼠棉球植入法 （1）原理： 棉球植入大鼠體內(nèi)引起結締組織增生，這種增生與慢性炎癥后期病理改變相似，用于評定抗炎藥物抗增殖作用。,基本方法： 大鼠乙醚淺麻后下腹消炎，腹股溝皮下植入滅菌棉球（事先加入氨芐青霉素，防止大鼠局部感染），手術后連續(xù)給藥7天，第8天脫頸椎，取出棉球稱重，減去棉球原重，即為肉芽腫重量*，然后計算抑制率并進行統(tǒng)計分析。 *為消除體重因素影響，肉芽腫重量以m

32、g（肉芽腫）/100g（體重）表示。,肉芽腫概念： 常見于慢性的增生性炎癥，由巨噬細胞及其演化細胞浸潤增生形成的境界清楚的結節(jié)狀病灶。,知識鏈接,肉芽腫,肉芽腫分類： 異物性肉芽腫：外科縫線、木刺等異物引起肉芽腫。病變以異物為中心，周圍有多量巨噬細胞、異物巨細胞和成纖維細胞包繞，形成結節(jié)狀病灶。感染性肉芽腫：由病原微生物感染引起的肉芽腫，其增生的細胞成分在形態(tài)學上常具有一定的特殊性，對診斷有一定的意義。如結核性肉

33、芽腫。,結核性肉芽腫,,注意事項： ①棉球重量應盡量一致，50±1mg。 ②棉球形狀相近，搓成圓球狀。 ③注意無菌操作，防止感染。 ④植入部位盡量一致。,評價： ①本法是評定藥物抗增殖作用的最常用的方法。 ②對氫化可的松等甾體抗炎藥較為敏感，可做為陽性對照藥。 ③增生組織易向棉球內(nèi)浸潤，較難剝離，影響精確度。,4.大鼠佐劑性關節(jié)炎法 免疫反應性炎癥模型 變態(tài)反應也是免疫反應，不過是以組織

34、損傷功能紊亂為表現(xiàn)的免疫反應，臨床上類風濕關節(jié)炎即是一種變態(tài)反應性疾?。ɑ蚍Q超敏反應性疾病），它屬于免疫復合物型變態(tài)反應，即Ⅲ型變態(tài)反應。,,類風濕關節(jié)炎發(fā)病機理：抗原是變態(tài)的免疫球蛋白IgG（變性的抗體）與抗IgG抗體（類風濕因子）結合形成免疫復合物，中等大小，不易被吞噬，容易在關節(jié)滑膜處沉積，之后形成關節(jié)紅腫，疼痛，最終導致關節(jié)畸形，活動困難。,類風濕關節(jié)炎 關節(jié)畸形，活動困難,大鼠佐劑性關節(jié)炎病理模型： 主要由兩種變態(tài)

35、反應造成。 （1）Ⅳ型變態(tài)反應（遲發(fā)型變態(tài)反應）抗原致敏T細胞--再次接觸抗原--T細胞分化增殖 TDTH（遲發(fā)致敏）→釋放淋巴因子（IL-1） → Tc（細胞毒） → 殺傷靶細胞 →單核巨噬細胞浸潤為主炎癥反應 →機體組織損傷，皮炎。由于T細胞分化增殖，發(fā)展較緩慢。,,,(2)免疫復合物型變態(tài)反應（Ⅲ型）Ag → IgG、M等可形成復合物→ 在關節(jié)滑膜處沉積 → 造成關節(jié)腫脹（水腫、滲

36、出、變態(tài)、增殖）由于沉積須一段時間，發(fā)展較慢，持續(xù)時間也較長。,[方法]（1）制備Freund’s完全佐劑 將液體石蠟和羊毛脂（2：1）在70oC共熱振搖，高壓滅菌，然后每ml加7.5mg卡介苗或死的結核桿菌制成。即制成Freund’s完全佐劑。 注：佐劑為非特異性的免疫增強劑，可以增強機體對抗原的免疫應答。,（2）選擇大鼠，隨機分組，在每鼠右后足跖皮內(nèi)注射Freund’s完全佐劑0.05ml致炎。

37、（3）病變： 　A. 原發(fā)病變：主要表現(xiàn)為致炎局部的炎癥反應，致炎后18小時右腳爪腫脹達高峰，持續(xù)3天，逐漸減輕。,,B.繼發(fā)病變（由于遲發(fā)性變態(tài)反應所致）：一般出現(xiàn)于致炎后10~12天左右，表現(xiàn)為四肢皆出現(xiàn)腫脹，耳和尾部出現(xiàn)關節(jié)炎小結，體重下降。,,（4）觀察指標與給藥方案 A．觀察藥物對原發(fā)性病變的影響：于致炎前30~60分鐘預防給藥，主要觀察致炎后 18小時右后足的腫脹程度。 （意義不大，可由大鼠角叉菜膠致足跖腫脹法

38、代替）,B. 觀察藥物對繼發(fā)的多發(fā)性關節(jié)炎的影響。 為本模型實驗目的對全身病變按以下打分：（主要觀察足爪）0分：無紅腫1分：小趾關節(jié)稍腫2分趾關節(jié)和足跖腫脹 3分踝關節(jié)以下的足爪腫脹4分全部足爪腫脹,,給藥方法：A.如是觀察藥物對多發(fā)性關節(jié)炎預防作用，可于佐劑注射一周后開始給藥，每天一次，連續(xù)7天，觀察有無預防作用。B.如是觀察治療作用，則在佐劑注射后第19天給藥，每天一次，連續(xù)7天。,,（5）病理組織學檢查：取炎

39、性踝關節(jié)，脾臟，胸腺進行病理組織學檢查，檢查T、B細胞分化程度，檢查關節(jié)炎嚴重程度，巨噬細胞吞噬情況（炎癥細胞浸潤程度）。,[注意事項] ① 成敗關鍵在于佐劑的制備及皮內(nèi)的注射 ② 大鼠年齡及免疫狀態(tài)可能影響發(fā)病率，一般選擇2~3月齡大鼠（170~200g）。 [評價] ①  多發(fā)性關節(jié)炎（四肢皆出現(xiàn)腫脹）是本模型的特征，較為接近人類風濕關節(jié)炎。 ②  對抗炎藥和免疫