甜菜夜蛾海藻糖酶和幾丁質(zhì)酶在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá).pdf

1、幾丁質(zhì)是昆蟲(chóng)生長(zhǎng)和發(fā)育的關(guān)鍵物質(zhì)。海藻糖酶與幾丁質(zhì)酶是昆蟲(chóng)幾丁質(zhì)合成與降解過(guò)程中的兩種重要的酶。海藻糖酶(Trehalase，EC3.2.1.28)能夠?qū)Ｒ恍缘卮呋夂Ｔ逄?。昆蟲(chóng)海藻糖酶通常分為兩種，可溶性海藻糖——海藻糖酶1(Tre-1)與膜結(jié)合型海藻糖酶——海藻糖酶2(Tre-2)。幾丁質(zhì)酶(Chitinase，EC3.2.1.14)屬于水解酶第18家族，能夠特異性地水解多聚幾丁質(zhì)。幾丁質(zhì)酶是一個(gè)多基因家族，昆蟲(chóng)體內(nèi)常有多種幾丁質(zhì)

2、酶和類(lèi)幾丁質(zhì)酶蛋白，其中細(xì)菌型幾丁質(zhì)酶(Chi-h)在幾丁質(zhì)降解的過(guò)程中同時(shí)具備內(nèi)切和外切幾丁質(zhì)酶活性。
　　 為了重組表達(dá)獲得有活性的海藻糖酶和幾丁質(zhì)酶，基于我們實(shí)驗(yàn)室已有的甜菜夜蛾Spodoptera exigua可溶性海藻糖酶SeTre-1、膜結(jié)合型海藻糖酶SeTre-2及細(xì)菌型幾丁質(zhì)酶SeChi-h基因，本文首先利用Bac-to-Bac昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，成功構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體pFastBac1-Tre-1、pFastBac1-

3、Tre-2與pFastBac1-Chi-h，在DH10Bac中將重組轉(zhuǎn)移載體中的目的基因轉(zhuǎn)座到Bacmid桿粒中，并在sf9細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)增獲得高滴度的重組桿狀病毒P-Tre-1、P-Tre-2與P-Chi-h。然后利用重組桿狀病毒感染Hi5細(xì)胞，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE及Western印跡分析和酶活測(cè)定，證明獲得有海藻糖水解活性的重組海藻糖酶rSeTre-1與rSeTre-2，以及具有幾丁質(zhì)水解活性的重組幾丁質(zhì)酶rSeChi-h。利用Ni-NT

4、A技術(shù)獲得了純化的rSeTre-1與rSeChi-h，其中rSeTre-1的酶活力為264.3U/1 mg protein，表達(dá)量為25 mg/1 Lmedium；rSeChi-h的酶活力為2.22U/1 mg protein，表達(dá)量為32 mg/1 L medium。去糖基化實(shí)驗(yàn)還表明rSeTre-1有較高程度的N-糖基化，N-糖基相對(duì)含量為約10％。
　　 此外，本研究還分析了重組海藻糖酶rSeTre-1的酶學(xué)特性，發(fā)現(xiàn)rS