甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）幾丁質(zhì)合成通路中重要基因的特性與轉(zhuǎn)錄調(diào)控初步研究.pdf

1、幾丁質(zhì)廣泛存在于真菌、昆蟲和甲殼動(dòng)物中，幾丁質(zhì)的合成是一個(gè)高度復(fù)雜的、多方面聯(lián)系的一系列生化和生理過程。昆蟲體內(nèi)幾丁質(zhì)的生物合成通路在1962年首先被提出，始于海藻糖，終止于幾丁質(zhì)，其中共有8個(gè)酶參與，依次為海藻糖酶(Trehalase)、己糖激酶(Hexokinase)、葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(Glucose-6-phosphate isomerase)、谷氨酸鹽：果糖-6-磷酸轉(zhuǎn)氨酶(Glutamine：fructose-6-pho

2、sphate aminotransferase)、葡糖胺-6-磷酸-N-乙酰轉(zhuǎn)移酶(Glucosamine-6-phosphate N-acetyltransferase)、磷乙酰氨基葡萄糖變位酶(Phosphoacetylglucosamine mutase)、UDP-N-乙酰葡糖胺焦磷酸化酶(UDP-N-acetylglucosamine pyrophosphorylase)和幾丁質(zhì)合成酶(Chitin synthase)。這條通路

3、在南方粘蟲(Spodoptera eridania)等多種昆蟲中相繼被證明。但是，從基因水平研究幾丁質(zhì)合成卻很少，研究較多的是海藻糖酶基因和幾丁質(zhì)合成酶基因。 海藻糖為昆蟲的血糖，在脂肪體中合成并釋放到血淋巴中，在昆蟲發(fā)育和能量代謝中具有重要的作用。首先，我們采用HPLC系統(tǒng)測(cè)定了甜菜夜蛾5齡幼蟲和蛹期血淋巴中海藻糖和葡萄糖的含量，發(fā)現(xiàn)它們之間呈負(fù)相關(guān)。其次，根據(jù)昆蟲已知的基因設(shè)計(jì)引物先擴(kuò)增到中間片段，再采用RACE的方法獲得了

4、甜菜夜蛾海藻糖酶(SeTreh-2)和海藻糖合成酶(SeTPS)基因。通過分析發(fā)現(xiàn)SeTreh-2編碼645個(gè)氨基酸，推測(cè)的分子量和等電點(diǎn)分別為73.88kDa和6.01，并且包含一個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)，因此是膜結(jié)合海藻糖酶：而SeTPS編碼826個(gè)氨基酸，推測(cè)的分子量為92.65kDa，等電點(diǎn)為6.69，Blast發(fā)現(xiàn)其包含了TPS(OtsA)和TPP(OtsB)兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。Northern blot和RT-PCR分析表明，SeTreh-2在甜

5、菜夜蛾的脂肪體、中腸和馬氏管中有大量表達(dá)，而SeTPS只存在于脂肪體和馬氏管中。這說明海藻糖可以在脂肪體和馬氏管中合成，釋放到血淋巴中并由其輸送到各個(gè)組織，可以由中腸中的海藻糖酶降解，為各組織提供能量。SeTreh-2在脂肪體和馬氏管中可能起平衡功能。我們采用RT-PCR結(jié)合Southern Blot的方法分析不同發(fā)育階段中SeTreh-2基因的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SeTreh-2基因在脂肪體和中腸存在兩種不同的表達(dá)模式，這顯示出其功能的不同

6、。SeTPS在脂肪體的表達(dá)與血淋巴中的海藻糖含量呈正相關(guān)，這表明海藻糖在甜菜夜蛾的脂肪體中通過SeTPS合成后，迅速地被釋放到了血淋巴中，再隨著血淋巴循環(huán)輸送到其它的組織。在已經(jīng)克隆得到的幾丁質(zhì)合成酶(SeCHSA和SeCHSB)cDNA和前面獲得的SeTreh-2和SeTPS的基礎(chǔ)上，構(gòu)建了甜菜夜蛾的基因組文庫，篩選得到了SeCHSA、SeCHSB、SeTreh-2和SeTPS的基因組DNA序列。通過與相關(guān)基因cDNA序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，S

7、eCHSB、SeTreh-2和SeTPS分別包含24、13和12個(gè)外顯子及23、12和11個(gè)內(nèi)含子。Southern blot的結(jié)果表明：SeCHSB和SeTreh-2為單拷貝基因，且都存在兩種類似的基因，而SeTPS為雙拷貝基因。通過5’RACE確定基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)后，獲得SeCHSA、SeCHSB和SeTPS基因的啟動(dòng)子序列分別為：1053bp、1640bp和3330bp。 為進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)錄因子對(duì)幾丁質(zhì)合成通路的調(diào)控，我們

8、對(duì)獲得的SeCHSA、SeCHSB和SeTPS基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其含有眾多的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的結(jié)合位點(diǎn)，其中fork head、CCAAT-Box、BR-C、GATA-Box和Pou的結(jié)合位點(diǎn)較多。我們又通過構(gòu)建不同長度的啟動(dòng)子缺失片段熒光素酶報(bào)告基因轉(zhuǎn)染到Hi5細(xì)胞系中，采用多功能熒光儀測(cè)定活性。結(jié)果分析表明，幾丁質(zhì)的合成受fork head轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控。因此，我們進(jìn)而克隆獲得了甜菜夜蛾fork head的cDNA，其編碼