團(tuán)頭魴三種細(xì)胞系的建立、鑒定及其初步應(yīng)用.pdf

1、團(tuán)頭魴（Megalobrama amblycephala），俗稱武昌魚，隸屬于鯉形目，鯉科，鳊亞科，魴屬，原產(chǎn)于我國，起初分布于長江中下游附屬的湖泊，自1964年馴化成功后，因其存活率高、生長快、食草性、營養(yǎng)價(jià)值高、病害少和易捕撈等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)已推廣到全國各地養(yǎng)殖。近年來，由于過度捕撈、水域污染和近親交配，團(tuán)頭魴種質(zhì)出現(xiàn)嚴(yán)重退化和混雜現(xiàn)象，養(yǎng)殖群體出現(xiàn)性早熟、生長速度減慢和疾病增多等。目前對團(tuán)頭魴的研究集中在生物學(xué)、免疫、疾病、營養(yǎng)及遺傳育

2、種等多個(gè)方面，而對團(tuán)頭魴細(xì)胞培養(yǎng)方面的研究報(bào)道還很匱乏。因此本研究建立了團(tuán)頭魴鰭條、肌肉和心臟細(xì)胞系，對3種細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并將其初步應(yīng)用于病毒學(xué)、環(huán)境毒物檢測和遺傳學(xué)等領(lǐng)域。以期將這3種細(xì)胞系作為體外體系運(yùn)用于團(tuán)頭魴各方面的研究，為團(tuán)頭魴的養(yǎng)殖和育種提供基礎(chǔ)資料;運(yùn)用于環(huán)境毒物檢測，以確立敏感合適的細(xì)胞體外模型應(yīng)用于毒物毒性的早期預(yù)警研究。具體內(nèi)容及研究結(jié)果如下:
　　 (1)團(tuán)頭魴三種細(xì)胞系的建立與鑒定
　　 用組織塊

3、貼壁法建立了團(tuán)頭魴鰭條、肌肉和心臟細(xì)胞系，在一年多的時(shí)間內(nèi)分別傳代到95代、86代和71代以上，分別命名為MAF、MAM和MAH。3-6個(gè)月凍存后，MAF、MAM和MAH細(xì)胞復(fù)蘇存活率分別為92.92±5.38％，90.04±5.49％和91.54±6.55％。MAF、MAM和MAH細(xì)胞適宜的生長溫度為28-32℃，生長培養(yǎng)基為M199，培養(yǎng)基中血清濃度的添加量為10％。第10代的MAF、MAM和MAH細(xì)胞染色體數(shù)目為48分別占62％、

4、59％和65％，說明3種細(xì)胞屬正常二倍體細(xì)胞。30代MAF、MAM和MAH細(xì)胞的12s rRNA片段序列與已報(bào)道的團(tuán)頭魴12srRNA序列一致率為99％-100％，表明3種細(xì)胞確實(shí)來自于團(tuán)頭魴。60代MAF、MAM和MAH細(xì)胞與細(xì)胞角蛋白，纖連蛋白，結(jié)蛋白和Ki67抗體均呈陽性反應(yīng)，表明3種細(xì)胞增殖能力強(qiáng)，呈現(xiàn)出上皮樣和成纖維樣混合狀。
　　 (2)團(tuán)頭魴鰭條細(xì)胞的初步應(yīng)用
　　 以MAF細(xì)胞為研究對象，測定黑魚棒狀病毒

5、(SHRV)，鯉春病毒血癥病毒(SVCV)，斑點(diǎn)叉尾鮰病毒(CCV)和草魚呼腸孤病毒(GCRV)對MAF細(xì)胞的敏感性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，MAF細(xì)胞對SHRV，SVCV和CCV較敏感，分別在感染后的1d、2d和2d出現(xiàn)典型的病變;MAF細(xì)胞對GCRV不敏感。PCR技術(shù)確認(rèn)了MAF細(xì)胞被SHRV、SVCV和CCV感染，而不能被GCRV感染。SHRV、SVCV和CCV在MAF細(xì)胞中病毒滴度分別達(dá)到1082，106.8和105.9 TCID50 m

6、l-1。MAF細(xì)胞對嗜水氣單胞菌胞外產(chǎn)物敏感，24 h細(xì)胞的形態(tài)即發(fā)生改變，細(xì)胞皺縮、變圓，最終整個(gè)單層脫落。MAF細(xì)胞對重金屬銅也很敏感，24 h半致死濃度為144.48±13.25μmol/L。用脂質(zhì)體2000能成功將pEGFP-N1轉(zhuǎn)入到MAF細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染效率為5％。上述結(jié)果表明MAF作為體外體系能應(yīng)用于病毒學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)等領(lǐng)域。
　　 (3)全氟辛酸對團(tuán)頭魴肌肉細(xì)胞的毒性研究
　　 采用MTT法、細(xì)胞總蛋

7、白含量(CP)、中性紅攝取試驗(yàn)（NR）法和CCK-8試劑盒測定全氟辛酸對MAM細(xì)胞的毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:設(shè)定的全氟辛酸濃度都對MAM細(xì)胞的生長有抑制作用，且細(xì)胞存活率的降低與全氟辛酸濃度呈正相關(guān)。24h IC50值分別為240.81±10.66 mg/L、243.96±11.65 mg/L、248.63±13.95mg/L和223.62±13.97 mg/L，48 h IC50值分別為214.01±10.48mg/L、219.86±10

8、.13 mg/L、235.57±8.43 mg/L和210.40±8.32 mg/L，4種方法測定24 h和48 h IC50值的大小順序?yàn)镹R＞ CP＞MTT＞CCK-8，經(jīng)分析4種方法測定的24 h和48 h IC50值沒有顯著性差異(P＞0.05)。50 mg/L和100 mg/L全氟辛酸對MAM細(xì)胞暴露染毒后48 h，MAM細(xì)胞不飽滿，有皺縮的趨勢，100mg/L組更明顯;掃描電鏡結(jié)果顯示:50mg/L全氟辛酸暴露后，MAM細(xì)胞