幾種重要海水養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的建立、誘導(dǎo)分化及其應(yīng)用研究.pdf

1、魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系的建立始于上世紀(jì)60年代，由Wolf和Quimby建立了世界上第一個(gè)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系．虹鱒生殖腺細(xì)胞系RTG-2。隨后，魚(yú)類(lèi)細(xì)胞培養(yǎng)工作取得了較大的進(jìn)展，一些細(xì)胞系相繼建立成功。魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系因材料容易獲得、成本低、重復(fù)性好、實(shí)驗(yàn)條件可以精確控制等優(yōu)點(diǎn)，至今已成為一種重要的研究手段，廣泛應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)病毒學(xué)等各方面研究。對(duì)魚(yú)類(lèi)細(xì)胞系進(jìn)行深入研究無(wú)論在理論研究方面還是在實(shí)際應(yīng)用方面都具有深遠(yuǎn)意義。 本論文研究了半滑舌鰨(Cynoglo

2、ssus semilaevis)心肌細(xì)胞系(HTHC)和圓斑星鰈(Verasper variegates)腎臟細(xì)胞系(SHKC)的建立；同時(shí)還對(duì)半滑舌鰨胚胎細(xì)胞系(HEC)和日本牙鲆(Paralichthys olivaceus)胚胎細(xì)胞系(FEC)進(jìn)行了干細(xì)胞功能的誘導(dǎo)分化；并將大菱鲆胚胎細(xì)胞(TEC)應(yīng)用于大菱鲆GRIM19基因的功能研究工作上。半滑舌鰨心肌細(xì)胞系和圓斑星鰈腎臟細(xì)胞培養(yǎng)在添加有20％FBS，1 mM的L-谷氨酸，50

3、 mM的2-ME，100 UI/ml青霉素，100 ug/ml鏈霉素，10 ng/ml bFGF的MEM培養(yǎng)基中，兩種細(xì)胞的形態(tài)均為成纖維樣細(xì)胞。HTHC細(xì)胞至今已傳代30余代；SHKC細(xì)胞至今已傳代40余代。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了FBS、bFGF、溫度對(duì)HTHC和SHKC細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。在一定范圍內(nèi)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度隨FBS濃度的增高而加快，F(xiàn)BS濃度過(guò)高或過(guò)低都抑制細(xì)胞的增殖。bFGF對(duì)HTHC細(xì)胞生長(zhǎng)具有刺激作用。HTHC和SHKC細(xì)胞在24-

4、30℃之間細(xì)胞生長(zhǎng)良好，當(dāng)溫度高于30℃或低于12℃時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)速度降低。HTHC細(xì)胞的二倍體核型為2n=42；SHKC細(xì)胞的的二倍體核型為2n=46，將EGFP報(bào)告基因通過(guò)脂質(zhì)體(lipofectamine2000)介導(dǎo)的方法成功轉(zhuǎn)入HTHC和SHKC細(xì)胞中并獲得了表達(dá)，轉(zhuǎn)化率為10-15％左右。用牙鲆淋巴囊腫病毒(LCVD)感染HTHC和SHKC細(xì)胞，觀察到了細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，透射電鏡檢測(cè)均在細(xì)胞內(nèi)發(fā)現(xiàn)了大量病毒顆粒。

5、 半滑舌鰨胚胎細(xì)胞系(HEC)和日本牙鲆胚胎細(xì)胞系(FEC)為本實(shí)驗(yàn)室建立保存。HEC和FEC都具有發(fā)育上的多能性，在特定的誘導(dǎo)條件下，都可以誘導(dǎo)分化為纖維細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等各種類(lèi)型的細(xì)胞。全反式視黃酸(RA)、明膠、低濃度FBS均可以誘導(dǎo)兩種胚胎細(xì)胞分化為纖維細(xì)胞；二甲基亞砜和低密度種植HEC細(xì)胞均可以誘導(dǎo)HEC細(xì)胞分化為樹(shù)狀肌肉細(xì)胞；HEC和FEC細(xì)胞在低密度條件下均分化為神經(jīng)細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、上皮細(xì)胞；HEC和FEC細(xì)胞堿性

6、磷酸酶染色均呈陽(yáng)性，這些結(jié)果初步表明HEC和FEC胚胎細(xì)胞具有干細(xì)胞的分化特征。將EGFP報(bào)告基因通過(guò)脂質(zhì)體(lipofectamine2000)介導(dǎo)的方法成功地轉(zhuǎn)入HEC和FEC中并獲得了表達(dá)；用牙鲆淋巴囊腫病毒(LCDV)感染HEC和FEC細(xì)胞，觀察到了細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)，通過(guò)透射電鏡觀察到在細(xì)胞內(nèi)有大量病毒顆粒。 我們從大菱鲆脾臟cDNlA文庫(kù)中鑒定出-GRIM19基因，并得到該基因的DNA全長(zhǎng)。利用RT-PCR技術(shù)對(duì)

7、該基因進(jìn)行了在大菱鲆正常組織、不同胚胎發(fā)育階段、鰻弧菌(Vibrio anguillaru，ATCC19019)感染組織和細(xì)胞中的表達(dá)分析，初步探討了GRIM19基因在魚(yú)類(lèi)先天免疫系統(tǒng)中作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：GRIM19全長(zhǎng)cDNA含有一個(gè)17bp的5'UTR，一個(gè)435bp的開(kāi)放閱讀框(open readingframe，ORF)和一個(gè)143bp的3'UTR，開(kāi)放閱讀框編碼了144個(gè)氨基酸殘基。通過(guò)比較cDNA序列和基因組序列發(fā)現(xiàn)GRI

8、M19基因內(nèi)含有5個(gè)外顯子和4個(gè)內(nèi)含子?；蚪MSouthern結(jié)果表明該基因?yàn)閱慰截惢?。系統(tǒng)發(fā)生分析表明大菱鲆能夠與大西洋庸鰈聚在一起。該基因在正常大菱鲆免疫系統(tǒng)中表達(dá)強(qiáng)烈，尤其是在脾臟和頭腎中；GRIM19在大菱鲆胚胎不同發(fā)育時(shí)期表達(dá)逐漸增強(qiáng)；在感染頭腎、肝臟、脾臟三種組織中，該基因表達(dá)均有增加趨勢(shì)：在感染頭腎中該基因表達(dá)最強(qiáng)烈，在肝臟感染24h時(shí)基因表達(dá)達(dá)到最高水平，而在脾臟中該基因表達(dá)一直增強(qiáng)；鰻弧菌感染大菱鲆胚胎細(xì)胞后，GRI