豬戊型肝炎病毒的分子流行病學(xué)調(diào)查及ORF2區(qū)的克隆和表達.pdf

1、戊型肝炎是一種由戊型肝炎病毒引起的，經(jīng)過糞-口途徑傳播的新發(fā)傳染病和人畜共患病。人與豬易感，其中豬是重要的儲存宿主和傳染源。
　　 本研究首先應(yīng)用HEVELISA抗體檢測試劑盒對湖北地區(qū)4個豬場80份血清進行HEV抗體IgG檢測，結(jié)果顯示檢測的80份血清中陽性血清56份，抗-HEV抗體陽性率高達70.0％。
　　 在此基礎(chǔ)上，從2007到2009年，我們從湖北、河南、安徽及湖南四省采集豬臨床肝臟樣品及肛拭子樣品共計583

2、份，根據(jù)GenBank中的序列（登錄號DQ279091）設(shè)計兩對引物，應(yīng)用套式RT-PCR方法檢測HEVRNA。將PCR擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒并測序，利用生物學(xué)軟件對其遺傳進化進行分析。結(jié)果表明：從樣品分析，HEV總陽率為9.6％(56/583)，肝臟樣品陽性率為15.55％(21/135)，肛拭子樣品陽性率為7.81％(35/448)；從豬場分析，9個豬場中有5個豬場存在HEV，豬場陽性率平均為55.56％(

3、5/9)。將其中具有代表性的兩株病毒的PCR產(chǎn)物克隆并提交NCBI，獲得了GenBank登錄號，其中肝臟樣品登錄號為：GQ202266，肛拭子樣品登錄號為：FJ445406。序列分析表明：38株陽性樣品之間同源性為92-100％，與戊型肝炎病毒基因Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型同源性分別為77％、77％、87％、96％。遺傳進化分析顯示，從肛拭子中分離的毒株(FJ445406)與豬源毒株DQ279091處在同一分支上，屬于基因4型；肝臟中分離的毒株(

4、GQ202266.1)雖然處在4型分支上，但和4型人源毒株處在一個亞支，屬于4型中另一亞型，提示該毒株可能是與人源毒株親緣關(guān)系較近?？傮w來講，華中地區(qū)豬群中存在HEV，其基因型相對穩(wěn)定，屬同一基因型（4型）。
　　 由于戊型肝炎病毒缺乏有效的細胞模型，研究進展相當(dāng)緩慢。我們在前人研究的基礎(chǔ)上，利用A549和IBRS-2、HepG2三種細胞系分別接種HEV的肝臟樣品和肛拭子樣品，并作3次重復(fù)。結(jié)果表明：A549和IBRS-2兩種細

5、胞系均能增殖HEV病毒，并能穩(wěn)定傳代。其中在A549細胞系中病毒能連續(xù)傳代21代；IBRS-2細胞系中病毒能連續(xù)傳代12代以上。用RT-nPCR檢測細胞內(nèi)核酸發(fā)現(xiàn)，A549細胞中第一代（前4天）檢測不出HEVRNA，但在IBRS-2中卻能檢測到。以上研究進一步豐富了HEV細胞模型。
　　 此外，本研究參照GenBank上登錄的人源AJ272108的cDNA序列設(shè)計了5對套式RT-PCR引物，分別擴增ORF2、VLP1、VLP2、

6、NE基因。將擴增產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體并測序，然后亞克隆至原核表達載體pET-28a，構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET-ORF2(1aa-674aa)、pET-VLP1(134aa-625aa)、pET-VLP2(147aa-540aa)、pET-NE(407aa-620aa)。將表達載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)，表達蛋白進行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和Westernblot蛋白印跡分析。結(jié)果表明：構(gòu)建的4個重組質(zhì)粒中pET-OR