江西省豬痘病毒的分離及其分子流行病學(xué)和血清學(xué)調(diào)查.pdf

1、豬痘(Swinepox)是由豬痘病毒(Swinepox virus，SWPV)引起豬的一種溫和或急性傳染病，以皮膚發(fā)生紅斑、丘疹、膿皰和結(jié)痂為特征，主要危害3月齡以內(nèi)的豬，成年豬很少發(fā)生或癥狀輕微，也有關(guān)于豬痘病毒胎盤感染導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎或初生仔豬發(fā)病的報道，呈世界性分布。豬痘可通過豬虱等的叮咬機械傳播，與豬的飼養(yǎng)衛(wèi)生條件差相關(guān)。由于豬痘給養(yǎng)豬業(yè)造成的直接損失較小，通常被忽視。本試驗通過豬痘病毒的分離及其分子流行病學(xué)和血清學(xué)調(diào)查，旨在了解

2、江西地區(qū)豬群中豬痘病毒的感染情況，為今后開展豬痘的流行病學(xué)、病毒的生物學(xué)特性、豬痘病毒作為表達載體等的研究打下基礎(chǔ)。
　　1.豬痘病毒PCR檢測方法的建立與應(yīng)用
　　根據(jù)GenBank上登錄的豬痘病毒(登錄號：AF410153.1)P35基因序列，設(shè)計并合成1對引物，擴增目的片段為975bp。以疑似豬痘的皮膚痘痂提取DNA，通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測豬痘病毒PCR方法。特異性、重復(fù)性和敏感性試驗表明，該方法特異性高、重

3、復(fù)性良好、對模板的最低檢測量為2.7×10-8μg。以建立的PCR檢測方法對收集自江西地區(qū)的55份疑似豬痘保育豬皮膚痘痂進行PCR檢測，結(jié)果有44份為豬痘病毒陽性，陽性率為80％，表明江西省豬群存在豬痘病毒感染。
　　2.豬痘病毒分離及P35基因的同源性分析
　　以PCR檢測為豬痘病毒陽性的保育豬皮膚痘痂為病毒分離材料，采用PK15細胞盲傳方式進行豬痘病毒的分離，通過對PK15細胞培養(yǎng)物進行豬痘病毒P35基因的PCR擴增和測

4、序確定病毒分離的成功。從江西省分離到15株豬痘病毒，分別命名為SWPV-JX01～SWPV-JX15。所有分離毒株在PK15細胞上均不產(chǎn)生明顯的CPE，感染的PK15細胞均能連續(xù)傳代，僅造成死細胞偏多、胰酶消化時間縮短。以分離株SWPV-JX07人工感染兔和小鼠試驗，表明能在兔體內(nèi)增殖，不能在小鼠體內(nèi)增殖。通過對分離毒株P(guān)35基因核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進行同源性比較分析，結(jié)果表明：(1)分離毒株間的核苷酸序列同源性為98.1％～

5、100％，推導(dǎo)氨基酸序列同源性為98.2％～100％；(2)分離毒株與豬痘病毒(AF410153.1)的P35基因核苷酸序列同源性為96.6％～98.2％，氨基酸序列同源性為87.5％～88.5％。
　　3.豬痘病毒P35基因的原核表達
　　將豬痘病毒P35基因克隆至原核表達載體pGEX-4T-1，構(gòu)建原核表達重組質(zhì)粒pGEX-4T-P35，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達，SDS-PAGE分析表明，表達

6、產(chǎn)物分子量約為64kDa(GST蛋白26kDa，P35蛋白約38kDa)，與預(yù)期大小一致；通過蛋白純化和濃度測定，獲得濃度約700μg/mL P35重組蛋白；以純化的重組蛋白免疫BALB/c小鼠(70μg/次·只)，連續(xù)免疫三次后采血，抗體效價達到1:102400，表明該P35重組蛋白具有良好的免疫原性。
　　4.豬痘病毒抗體間接ELISA檢測方法的建立及江西地區(qū)豬痘病毒血清學(xué)調(diào)查
　　以P35重組蛋白為檢測抗原包被96孔酶

7、標(biāo)板，建立了檢測豬血清中豬痘病毒抗體的間接ELISA方法，該方法的最佳包被抗原濃度為10μg/mL，豬血清最佳稀釋度為1:80，兔抗豬IgG酶標(biāo)二抗的稀釋倍數(shù)為1:5000。以建立的ELISA方法對2006年～2012年江西地區(qū)258個養(yǎng)豬場的2530豬血清樣品進行豬痘病毒抗體檢測，結(jié)果.1045份為豬痘病毒抗體陽性，血清總陽性率為41.3％(1045/2530)；豬場陽性率為90.7％(234/258)；其中母豬、哺乳仔豬、保育豬和生