廣藿香毛狀根培養(yǎng)及細(xì)胞懸浮系建系的研究.pdf

1、廣藿香［Pogostemon cablin(Blanco) Benth.］為唇形科刺蕊草屬植物，以干燥地上部分入藥，其性辛、微溫，為常用的傳統(tǒng)中藥，同時也是“十大廣藥”之一。本研究以廣藿香葉片為外植體，誘導(dǎo)廣藿香無菌苗，并以廣藿香無菌苗為實驗材料，對發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)廣藿香毛狀根以及廣藿香細(xì)胞懸浮培養(yǎng)進(jìn)行研究，主要研究結(jié)果如下：
　?。?）廣藿香毛狀根的誘導(dǎo)及鑒別
　　本研究以發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834及C58C1侵染廣藿香無

2、菌苗葉片外植體，分別研究發(fā)根農(nóng)桿菌侵染的最佳時間、乙酰丁香酮濃度、預(yù)培養(yǎng)時間、侵染時間、共培養(yǎng)時間對廣藿香毛狀根誘導(dǎo)率的影響，并利用 PCR技術(shù)對所誘導(dǎo)的毛狀根進(jìn)行鑒別。
　　研究表明，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834在140 r/min、28℃、黑暗條件下振蕩培養(yǎng)18 h；發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1在同樣條件下振蕩培養(yǎng)19h，OD600值均為0.6，可用于侵染外植體。廣藿香毛狀根誘導(dǎo)的最佳條件為：預(yù)培養(yǎng)時間2 d，乙酰丁香酮質(zhì)量濃度15

3、mg/L，侵染時間25 min，共培養(yǎng)時間2 d，發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834和C58C1誘導(dǎo)率均達(dá)到最高，分別為83.3％和80.5%。PCR擴(kuò)增結(jié)果證實，發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA部分已在廣藿香毛狀根的基因組中整合及表達(dá)，廣藿香毛狀根被成功誘導(dǎo)。
　?。?）廣藿香毛狀根植株再生及鑒別
　　本研究利用“兩步法”，研究在不同激素配比以及不同培養(yǎng)條件下對廣藿香毛狀根誘導(dǎo)愈傷組織的影響。研究表明，誘導(dǎo)廣藿香毛狀根再生植株的最

4、佳條件為：在光照14h/d，25±2℃，MS+6-BA(2.0mg/L)+NAA(0.1 mg/L)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)愈傷組織，30d后誘導(dǎo)率為100%；在MS+NAA(0.1 mg/L)+6-BA(0.1 mg/L)培養(yǎng)基中誘導(dǎo)芽分化，35d后誘導(dǎo)率為100%；在1/2MS培養(yǎng)基中生根培養(yǎng)，20d后生根率為100%。PCR擴(kuò)增結(jié)果證實，發(fā)根農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒的T-DNA部分已在廣藿香毛狀根再生植株的基因組中整合及表達(dá)。
　?。?）廣藿香疏

5、松愈傷組織誘導(dǎo)
　　本研究以MS培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，研究在不同激素配比以及培養(yǎng)條件下對誘導(dǎo)廣藿香疏松愈傷組織的影響。研究表明，在光照14h/d，25±2℃，MS+2,4-D（0.05 mg/L）+ KT(0.5mg/L)培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為87.5%，多次繼代后可獲得白色或黃白色疏松愈傷組織。
　　（4）廣藿香懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系建立及百秋李醇含量測定
　　分別研究光照、轉(zhuǎn)速、接種量、溫度、碳源對廣藿香懸浮細(xì)胞生長的影

6、響，建立懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系；研究SA和MJ對廣藿香懸浮細(xì)胞生長以及百秋李醇含量的影響。
　　研究表明，廣藿香懸浮細(xì)胞生長曲線呈S型，9-15d為對數(shù)期，24d為一個生長周期；廣藿香懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系最佳條件為：光照24h/d，轉(zhuǎn)速135r/min，接種量7g/100ml，溫度25±2℃，碳源為蔗糖30g/L，振蕩培養(yǎng)18d，廣藿香懸浮細(xì)胞FW為529.8795g/L。SA濃度為1 mg/L時，對廣藿香懸浮細(xì)胞生長具有促進(jìn)作用，F(xiàn)W為5