人角膜緣上皮細(xì)胞建系的研究.pdf

1、目的：通過體外連續(xù)傳代培養(yǎng)，建立具有正常生物學(xué)特性和功能的人角膜緣上皮細(xì)胞系，為角膜上皮細(xì)胞的研究和組織工程化角膜的構(gòu)建提供種子細(xì)胞。 方法：取材中山眼科中心角膜移植術(shù)后剩余的無菌角膜緣組織，利用消化培養(yǎng)法，組織塊培養(yǎng)法和飼養(yǎng)層培養(yǎng)法，體外培養(yǎng)和純化人角膜緣上皮細(xì)胞。經(jīng)過連續(xù)傳代培養(yǎng)，建立人角膜緣上皮細(xì)胞系。通過下列方法進(jìn)行細(xì)胞系的鑒定：①通過光鏡、電鏡，觀察細(xì)胞在傳代過程中形態(tài)學(xué)特征，用常規(guī)方法進(jìn)行細(xì)胞凍存和復(fù)蘇，觀察復(fù)蘇效率

2、；②通過MTT法繪制細(xì)胞生長曲線，計(jì)算群體倍增時(shí)間，掌握其生長和增殖規(guī)律；③通過有限稀釋法檢測細(xì)胞的克隆形成力，并挑取單克隆，體外擴(kuò)增和純化細(xì)胞系；④通過流式細(xì)胞技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞DNA倍體分析及周期檢測，觀察傳代細(xì)胞DNA和細(xì)胞周期的變化；⑤通過間接免疫熒光細(xì)胞染色、westem blot、反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)等方法檢測細(xì)胞蛋白表達(dá)：包括轉(zhuǎn)錄因子P63，角膜上皮細(xì)胞特異性蛋白角質(zhì)蛋白(cytokeratin)CK3和CK12

3、的表達(dá)，同時(shí)檢測CK19，CK14，波形蛋白(Vimentin)，微絲蛋白(F-actin)，微管蛋白(β-tubilin)和β1整合素(β1-integrin)等蛋白在細(xì)胞系中的表達(dá)情況；⑥對染色體進(jìn)行核型分析，觀察細(xì)胞在傳代過程中核型的變化；⑦利用雙瓊脂細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)對細(xì)胞進(jìn)行固著非依賴性生長分析(Anchorage independentgrowth assay)；將不同代數(shù)角膜緣上皮細(xì)胞接種到Balb/c裸小鼠皮下組織，觀察有

4、無致瘤性，評價(jià)細(xì)胞的生物安全性；⑧將細(xì)胞接種在Transwell培養(yǎng)皿中進(jìn)行氣液界面培養(yǎng)2周，觀察細(xì)胞系的體外復(fù)層形成能力。 結(jié)果：采用組織塊培養(yǎng)法成功建立了一株人角膜緣上皮細(xì)胞系(spontaneously derived human corneal epithelial cell line-SDHCEC1)。細(xì)胞在體外連續(xù)傳代已超過50代，經(jīng)過鑒定后，細(xì)胞系具有以下特征：①形態(tài)特點(diǎn)：細(xì)胞呈圓形、橢圓形，細(xì)胞表面可見豐富的微絨

5、毛。細(xì)胞漿內(nèi)可見大量的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，核糖體，微絲和微管等細(xì)胞合成、分泌旺盛的上皮細(xì)胞表征。按照常規(guī)方法進(jìn)行保存的細(xì)胞在-196℃凍存6個(gè)月之后，復(fù)蘇后活細(xì)胞比率大于85﹪。②細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)分析：細(xì)胞倍增時(shí)間為19.6小時(shí)，細(xì)胞在接種后24小時(shí)后進(jìn)入對數(shù)生長期，細(xì)胞增殖旺盛，狀態(tài)良好。③克隆特點(diǎn)及形成率：體外培養(yǎng)的人角膜緣上皮細(xì)胞的克隆形成率維持在5-6﹪左右。早代細(xì)胞(P<10代)形成的克隆小而緊密，后代細(xì)胞的克隆則比較松散，細(xì)胞的遷移性

6、增加。④細(xì)胞在傳代培養(yǎng)過程中，S期細(xì)胞的比例分別為23.2﹪、7.5﹪、6.1﹪、17.5﹪、11.4﹪、7.7﹪(P1-P50每隔十代)；DNA倍體分析表明細(xì)胞DNA含量向多倍體和異倍體發(fā)展。⑤SDHCEC1細(xì)胞表達(dá)角膜上皮細(xì)胞特異性蛋白CK3和CK12，同時(shí)還表達(dá)角膜緣上皮細(xì)胞的其他蛋白如CK19、CK14、Vimentin、F-actin，β-tubilin和β<,1>-integrin蛋白，而無P63蛋白的表達(dá)。⑥核型分析表明：

7、細(xì)胞系的染色體核型為多倍體，異倍體，染色體在細(xì)胞長期傳代培養(yǎng)過程中發(fā)生了斷裂和重組。⑦SDHCEC1細(xì)胞和陰性對照組P3人角膜緣上皮細(xì)胞在雙瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)中均不能形成有效克隆(單克隆細(xì)胞數(shù)>5)，而33.2﹪視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤細(xì)胞-RB細(xì)胞(陽性對照組)在相同的條件下中可以形成有效克隆。細(xì)胞接種于裸鼠皮下80天后，未見有腫瘤生長。⑧采用氣液界面培養(yǎng)法培養(yǎng)SDHCEC1細(xì)胞2周，可形成3-4層復(fù)層角膜上皮。 結(jié)論：采用組織塊培養(yǎng)法

8、，通過連續(xù)傳代培養(yǎng)，結(jié)合人角膜緣上皮細(xì)胞在傳代培養(yǎng)不同時(shí)期的生長特點(diǎn)改良培養(yǎng)技術(shù)，成功建立了一株人角膜緣上皮細(xì)胞系-SDHCEC1。SDHCEC1細(xì)胞系的建立避免了對細(xì)胞的基因操作，細(xì)胞在體外長期傳代的過程中能夠保持角膜上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)、生長動(dòng)力學(xué)、蛋白表達(dá)和復(fù)層形成能力，并且細(xì)胞系安全無致瘤性。為角膜上皮細(xì)胞增殖和分化的基因調(diào)控，細(xì)胞外基質(zhì)的合成，生長因子的作用，藥物的開發(fā)和毒性檢測等角膜上皮細(xì)胞的研究提供細(xì)胞來源，也可為構(gòu)建組織工程