中藥黃芩毛狀根培養(yǎng)及黃芩苷富集條件的研究.pdf

1、黃芩為唇形科(Labiatae)植物黃芩(Scutellaria baicalensis Georgi)的干燥根，是一味傳統(tǒng)的常用中藥。隨著目前對黃芩苷研究的深入，發(fā)現(xiàn)黃芩苷具有抗腫瘤、抗HIV等作用。以黃芩為資源，開發(fā)新的藥物前景將十分廣闊，又因黃芩為多年生草本植物，生長較慢，將會造成黃芩資源短缺，限制黃芩產(chǎn)品深度開發(fā)。利用黃芩毛狀根培養(yǎng)將使黃芩苷的生產(chǎn)實現(xiàn)工程化生產(chǎn)，生產(chǎn)過程進行標準化管理，有著重要的經(jīng)濟價值，同時將促進我國利用黃芩

2、毛狀根培養(yǎng)生產(chǎn)黃芩苷的研究及新的黃酮類藥物資源開發(fā)。 本課題是將現(xiàn)代生物技術與傳統(tǒng)中藥相結合，在國內(nèi)首次提出黃芩毛狀根培養(yǎng)系統(tǒng)的研究，建立中藥黃芩毛狀根離體培養(yǎng)體系，為黃芩苷的生產(chǎn)開辟新途徑。鑒于黃芩為雙子葉植物及國外有關黃芩屬植物毛狀根培養(yǎng)研究的報道，利用發(fā)根農(nóng)桿菌感染黃芩獲得毛狀根是完全可行的。 本文利用發(fā)根農(nóng)桿菌A4菌株，A4 9615菌株和1.2556菌株等侵染黃芩及其外植體，通過對發(fā)根農(nóng)桿菌的選擇、外植體的選擇

3、、農(nóng)桿菌侵染條件的優(yōu)化、除菌條件的確定、毛狀根鑒定，建立黃芩的毛狀根離體培養(yǎng)體系并對黃芩毛狀根培養(yǎng)條件優(yōu)化，富集黃芩苷。 研究表明，發(fā)根農(nóng)桿菌A4，A4 9615和1.2556侵染黃芩均能產(chǎn)生毛狀根，其中A4菌株侵染率最高，外植體以黃芩莖段較好，發(fā)根農(nóng)桿菌預培養(yǎng)時間為2天，添加300μg/mL乙酰丁香酮，侵染時間為20分鐘，共培養(yǎng)時間為2天，共培養(yǎng)的培養(yǎng)基為MS，轉入1/2MS，毛狀根除菌培養(yǎng)基添加500mg/L氨芐西林鈉的培養(yǎng)

4、條件最佳，黃芩毛狀根誘導率達40％。 將發(fā)根農(nóng)桿菌誘導的黃芩根與激素誘導的黃芩根進行比較后發(fā)現(xiàn)，發(fā)根農(nóng)桿菌誘導的黃芩根在形態(tài)上分枝多、生長迅速、無向地性、且不需添加外源激素，經(jīng)過反復多次繼代培養(yǎng)后，仍能夠保持原來的特性，而激素誘導的黃芩根在不含激素的培養(yǎng)基中繼代培養(yǎng)，根基本不生長，很少產(chǎn)生分枝，且逐漸死亡，這些特點說明發(fā)根農(nóng)桿菌誘導獲得的黃芩根確為黃芩毛狀根。 黃芩毛狀根液體培養(yǎng)的最佳條件：以1/2MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基

5、，pH在5.8-6.0之間，采用5％蔗糖為碳源，0.5g/L水解乳蛋白為氮源，28℃，110r/min，裝液量為250mL的三角瓶中裝100mL培養(yǎng)基，在暗處下培養(yǎng)30天較好，黃芩毛狀根生長量達23.37g(鮮重)/瓶。 通過薄層色譜法、紫外掃描法對黃芩毛狀根培養(yǎng)液及提取液進行成分分析，確定黃芩毛狀根提取液中含有黃芩苷；通過HPLC法定量測定黃芩毛狀根中黃芩苷含量，測定結果表明，培養(yǎng)30天的黃芩毛狀根中黃芩苷的含量達4.85％。