黃芩毛狀根培養(yǎng)體系優(yōu)化研究——Ⅲ.pdf

1、黃芩苷(Bacalin)為黃酮類化合物,大量存在于藥用植物黃芩(ScutellariabaicalensisGeorKi)的根部,具有清除氧自由基、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、抗炎、抗病毒(如HIV)和抗腫瘤的作用。近年來,隨著醫(yī)藥科技的發(fā)展,以黃芩苷及中藥黃芩為主要原料的藥品開發(fā)和生產(chǎn)與日俱增,而黃芩的種植面積卻逐年降低。農(nóng)藥的大量施用、藥材產(chǎn)地的污染等使藥材的質(zhì)量與安全問題也日漸嚴(yán)重。探索可替代中藥黃芩的新資源將對中醫(yī)藥發(fā)展有重要意義。

2、>　　 本論文以優(yōu)選的黃芩毛狀根為研究材料,對黃芩毛狀根的種屬、黃酮類成分合成的影響因素、黃芩苷合成的調(diào)控進(jìn)行了研究。此外,本論文構(gòu)建了含透明顫菌血紅蛋白基因的發(fā)根農(nóng)桿菌,為改善黃芩毛狀根抗低氧能力奠定了基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
　　 1.利用雙引物擴(kuò)增黃芩毛狀根內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(InternalTranscribedSpacer,ITS),其ITS為589bp。利用BLAST軟件進(jìn)行ITS序列比對,表明該序列與黃芩屬黃芩(Scute

3、llariabaicalensisGeorgi)(登錄號:AB557593.1)同源性為90%。獲得黃芩毛狀根的ITS登錄號為JF824665。表明研究所用黃芩毛狀根外植體來源于黃芩屬黃芩(ScutellariabaicalensisGeorgi)。
　　 2.黃芩毛狀根的HPLC指紋圖譜分析結(jié)果表明:黃芩毛狀根具有合成黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷及漢黃芩素等黃酮類成分的能力,其中以黃芩苷為主。以果糖為碳源培養(yǎng)的黃芩毛狀根培養(yǎng)30-

4、50d時(shí)與黃芩藥材相似度從0.660逐漸提高到0.987;以蔗糖或葡萄糖為碳源時(shí),培養(yǎng)30-50d的黃芩毛狀根與黃芩藥材相似度均高于0.9。利用黃芩毛狀根自身所具備的水解酶系對其水解并進(jìn)行高效液相指紋圖譜研究,結(jié)果表明黃芩毛狀根與黃芩藥材酶解后的指紋圖譜相似度為0.969,表明黃芩毛狀根存在水解酶系。
　　 3.建立了三級黃芩毛狀根的培養(yǎng)體系。黃芩毛狀根一級種子培養(yǎng)工藝為接種量5g/L,50g/L葡萄糖的改良MS液體培養(yǎng)基28℃

5、培養(yǎng)18d,搖床轉(zhuǎn)速110rpm。二級種子培養(yǎng)工藝為接種量5g/L,含0.2mmol/L苯丙氨酸、40z./L蔗糖、10g/L葡萄糖的改良MS液體培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)20d,搖床轉(zhuǎn)速110rpm。黃芩毛狀根三級培養(yǎng)工藝為接種量5g/L,含0.4mmol/L苯丙氨酸、60g/L蔗糖的改良的MS液體培養(yǎng)基采用20d變溫法(0-20d28℃培養(yǎng),21-40d20℃培養(yǎng))培養(yǎng)40d,搖床轉(zhuǎn)速為110rpm。利用三級培養(yǎng)體系獲得的毛狀根生物量為11.

6、52g/L,黃芩苷含量為20.99%。
　　 4.為實(shí)現(xiàn)在線監(jiān)測黃芩毛狀根的生物量,對生物量增y(g/L)與電導(dǎo)率x(mS/cm)的相關(guān)性進(jìn)行研究,得到方程:y=7.090x3-30.886x+24.914(R2=0.998),本方程可用于黃芩毛狀根生物量的在線監(jiān)測。
　　 5.為了提高黃芩毛狀根的抗低氧能力,本研究將pBI121-VHb質(zhì)粒轉(zhuǎn)化15834及R1000發(fā)根農(nóng)桿菌。為VHb基因轉(zhuǎn)入黃芩毛狀根中提供了有效工具