黃芩苷酶的制備及其理化性質(zhì)研究

1、黃芩苷酶的制備及其理化性質(zhì)研究黃芩苷酶的制備及其理化性質(zhì)研究任慧霞張敏山東大學(xué)藥學(xué)院生化與生物技術(shù)藥物研究所（濟(jì)南250012）摘要：目的要：目的研究黃芩苷酶的制備及其理化性質(zhì)。方法方法采用提取、透析、sephadexG150凝膠柱層析及冷凍干燥的方法獲得黃芩苷酶；利用LinewearBurk作圖法求得該酶對(duì)黃芩苷的Km值，研究了pH值、溫度、離子強(qiáng)度、底物濃度等對(duì)黃芩苷酶活力的影響。結(jié)果結(jié)果該酶對(duì)黃芩苷的Km值為57.4mmolL，最

2、適pH值為5.8，溫度為45℃，不同離子的影響、分子量，底物濃度及產(chǎn)物對(duì)該酶活性基本無影響，反應(yīng)初速度隨酶濃度的增加而增加并呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。結(jié)論結(jié)論獲得活性較高理化性質(zhì)較穩(wěn)定的一種黃芩苷酶。關(guān)鍵詞：關(guān)鍵詞：黃芩苷；糖苷酶；理化性質(zhì)關(guān)于PreparationacterizationaboutflavonoidsGlycosidaseRENHuixiaZHANGMinInstitueofBiochemicalBiotechnologic

3、alDrugSchoolofPharmaceuticalScienceShongUniversityJinan250012Abstract：PurposeTomeasuretheKmofthisflavonoidsGlycosidasefromScutellariabaicalensisGegiwithbaicalin，studytheeffectofpHtemperatureionicstrengthsubstrateconcentr

4、ationonenzymeactivitythelinearrelationofenzymeconcentration.MethodsUsingmeansofcollectiondislysissephadexG150columnchromatographytopreparecrudeenzyme.MeasuringKmbyLinewearBurkgraphicmethodcalculatetheenzymeactivitybymeas

5、uringtheabsbanceofbaicaleinat450nmwithultravioletspectrophotometry.ResultsTheKmwithbaicaleinis57.4mmolLitsoptimumpHtemperatureionicstrength1.2.1粗酶的分離純化1.2.1.1原料的預(yù)處理：稱取原料植物干燥粉末25g，加入十倍體積的蒸餾水溶解置于45℃烘箱內(nèi)過夜后，抽濾，棄殘?jiān)Ａ羯锨逡?，備用?.

6、2.1.2透析除去小分子：取上述上清液加入透析袋內(nèi)，用蒸餾水磁力攪拌透析，直至外液無色為止。1.2.1.3sephadexG150柱色譜：上述透析產(chǎn)物在室溫條件下使用AKTA分離層析系統(tǒng)上sephadexG150柱色譜，洗脫液是經(jīng)過濾和脫氣的蒸餾水，流速為1.0mLmin。分部收集，檢測(cè)酶活力并收集有酶活力的洗脫液。1.2.2酶活力單位IU定義測(cè)定條件下(pH值為5.8，45℃)每小時(shí)催化水解黃芩苷生成1μmol產(chǎn)物黃芩素所需的酶量為1

7、個(gè)酶活力單位（IU）。1.2.3粗酶活性測(cè)定：在空白和試驗(yàn)管中各加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)黃芩苷溶液，在45℃下水浴，再在試驗(yàn)管中加入相同體積的粗酶液，混勻，同時(shí)空白管中加入等體積的蒸餾水，45℃下精確反應(yīng)一定時(shí)間后，取出冷卻至室溫，后8000rmin離心20min倒出上清夜，保留沉淀，試驗(yàn)管沉淀用等量的甲醇溶解，空白管倒出上清夜后加入甲醇溶液做為對(duì)照，采用分光光度法在450nm處測(cè)定其吸光度。1.2.4黃芩素標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：配置一定濃度的黃芩素標(biāo)

8、準(zhǔn)溶液（溶劑為甲醇），然后用甲醇（分析純）依次稀釋至不同濃度，再以甲醇為空白，在450nm處測(cè)定各個(gè)濃度黃芩素溶液的吸光度，黃芩素溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，做出標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.2.5動(dòng)力學(xué)常數(shù)（Km）的測(cè)定：粗酶液與不同濃度的黃芩苷反應(yīng)，利用反應(yīng)中止法測(cè)定酶反應(yīng)的初速度（V），再根據(jù)LinewearBurk[5]作圖法求得該粗酶對(duì)黃芩苷的Km值。1.2.6理化性質(zhì)1.2.6.1pH值對(duì)酶活力的影響在不同的pH值（4.0，5.0，5