棉花懸浮細(xì)胞系的建立及其培養(yǎng)細(xì)胞的程序性死亡的觀察研究.pdf

1、細(xì)胞的死亡一般分為程序性死亡和壞死兩種。細(xì)胞程序性死亡(programmedcelldeath，PCD)是指生物在發(fā)育和脅迫反應(yīng)中的一種受基因控制的、主動(dòng)的、有序的細(xì)胞死亡過程。對(duì)動(dòng)物細(xì)胞程序性死亡的研究表明，PCD一般具有比較典型的形態(tài)和生化特征，即細(xì)胞收縮、核濃縮、染色質(zhì)邊緣化、核DNA被剪切成寡聚核小體大小的片斷并最終被膜包圍形成凋亡小體。核DNA降解斷裂產(chǎn)生帶有3、--OH端的寡聚核小體片斷，在凝膠電泳上呈以140-180bp倍

2、增的DNA“梯”(DNAladder)。壞死(necrosis)是一種不受細(xì)胞控制的損傷性細(xì)胞死亡過程，壞死細(xì)胞不能呈現(xiàn)出DNAladder。根據(jù)DNAladder的有無，可以將PCD與細(xì)胞壞死區(qū)分開來。對(duì)整株植物進(jìn)行PCD機(jī)理的研究常常要涉及到要將死亡細(xì)胞從正常細(xì)胞區(qū)分開來，而每個(gè)單個(gè)細(xì)胞細(xì)胞都有其內(nèi)在的死亡表達(dá)程序。因此，建立由單細(xì)胞或原生質(zhì)體組成的懸浮系可以大大的降低細(xì)胞環(huán)境的復(fù)雜性，可作為PCD研究的理想系統(tǒng)，對(duì)研究PCD的基因

3、表達(dá)調(diào)控機(jī)理和信號(hào)傳導(dǎo)途徑非常有利。近年來，對(duì)植物細(xì)胞程序性死亡的研究報(bào)道不斷增多，其中很多工作都是從懸浮細(xì)胞系著手的。 本試驗(yàn)選用陸地棉(Gossypiumhirsutum.L)品種“珂字201”和“鄂抗9”作為試驗(yàn)材料，從無菌苗下胚軸切段誘導(dǎo)愈傷組織，建立棉花懸浮細(xì)胞系；同時(shí)對(duì)棉花懸浮細(xì)胞系建立過程中激素的配比和濃度、培養(yǎng)基成分、懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)過程進(jìn)行了較系統(tǒng)的研究。結(jié)果表明：MS+2，4-D0.5mg/L+KT0.1mg/

4、L和MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L培養(yǎng)基有利于細(xì)胞分裂，能產(chǎn)生體積較大，均勻一致，細(xì)胞活力強(qiáng)的單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)，適合于進(jìn)行細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控及PCD研究。而MS+IBA0.5mg/L+KT0.1mg/L和MS+IBA0.1mg/L+KT0.1mg/L培養(yǎng)基則有利于形成大的細(xì)胞團(tuán)和不同時(shí)期的胚狀體，適合于進(jìn)行胚狀體的發(fā)生發(fā)育的研究。鉀鹽、肌醇有利于細(xì)胞的分裂增殖，且能抑制胚狀體的發(fā)生?？梢酝ㄟ^增加鉀鹽(K+)、肌醇含量來調(diào)節(jié)

5、細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)和細(xì)胞活性，以建成分裂增殖快、細(xì)胞活性強(qiáng)的懸浮細(xì)胞系。在懸浮培養(yǎng)過程中，管狀細(xì)胞漸漸消失，被球狀的單細(xì)胞和小細(xì)胞團(tuán)所替代。棉花胚性愈傷懸浮細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線呈S形，在起始培養(yǎng)的0～3d，是生長(zhǎng)的延遲期；在第3～15d，是指數(shù)增長(zhǎng)期；到第15d以后，生長(zhǎng)速度降低，是靜止期。懸浮培養(yǎng)的棉花細(xì)胞必須在15d以前進(jìn)行繼代，以保持其旺盛的分裂能力和細(xì)胞活性。 試驗(yàn)中以棉花懸浮細(xì)胞系為研究對(duì)象，探討了在自然衰老和在熱激、喜樹堿、串

6、珠鐮孢菌毒素、放線菌酮等誘導(dǎo)條件下細(xì)胞程序性死亡的發(fā)生機(jī)制。通過細(xì)胞學(xué)觀察和抽提基因組DNA進(jìn)行瓊脂糖膠電泳研究表明，棉花胚性懸浮細(xì)胞在MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第17天，細(xì)胞生活力開始下降；至第21天可檢測(cè)到核小體大小倍增的DNALadder存在。42±3℃熱激、10μmol/L喜樹堿、20μmol/L串珠鐮孢菌毒素和50mmol/L放線菌酮分別處理可誘導(dǎo)MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1

7、mg/L培養(yǎng)基中的棉花懸浮細(xì)胞發(fā)生程序性死亡。在MS+2，4-D0.1mg/L+KT0.1mg/L和MS+IBA0.1mg/L+KT0.1mg/L培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)的棉花胚性細(xì)胞處于不同的生理狀態(tài)，兩種不同狀態(tài)的棉花懸浮細(xì)胞對(duì)熱激、喜樹堿、串珠鐮孢菌毒素等誘導(dǎo)因子的反應(yīng)不同。 試驗(yàn)中還發(fā)現(xiàn)，棉花胚性懸浮細(xì)胞在僅含生長(zhǎng)素的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，生長(zhǎng)良好；但當(dāng)轉(zhuǎn)入到不含生長(zhǎng)素的MS培養(yǎng)基培養(yǎng)時(shí)，在1-7天內(nèi)則會(huì)大規(guī)模的死亡。對(duì)這些細(xì)胞進(jìn)

8、行染色(FDA、DAPI)和細(xì)胞學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)培養(yǎng)后第3-4天可見明顯的核質(zhì)濃縮、胞質(zhì)收縮，而高溫處理引起的細(xì)胞壞死無此現(xiàn)象。抽提懸浮細(xì)胞基因組DNA進(jìn)行凝膠電泳又發(fā)現(xiàn)：這種細(xì)胞死亡還伴隨有典型的DNALadder出現(xiàn)，而細(xì)胞壞死和對(duì)照無DNALadder。表明這種由生長(zhǎng)素撤除引起的細(xì)胞死亡是一種程序性死亡。且這種細(xì)胞死亡能被水解酶抑制劑(NEM、TLCK)和Caspase抑制劑(AC-YVAD-CMK)所抑制，從而進(jìn)一步證明這種細(xì)胞

9、死亡是一種PCD，同時(shí)也表明水解酶和類Caspase(CLPs)參與到了這類細(xì)胞程序性死亡(PCD)過程之中。 研究中還發(fā)現(xiàn)，棉花懸浮細(xì)胞經(jīng)高濃度細(xì)胞分裂素(2mg/LKT或4mg/LKT)處理后也大量死亡，培養(yǎng)物呈褐黑色；抽提總DNA，進(jìn)行瓊脂糖膠電泳，結(jié)果表明：2mg/LKT和4mg/LKT兩處理中有明顯的大小為140～180bp及其倍增量片段的DNA“梯”(DNALadder)。進(jìn)行PI和FDA染色顯微觀察可以看到：2mg

10、/LKT處理中大部分細(xì)胞的細(xì)胞核較小，核質(zhì)濃縮，呈棒形或彎月形；胞質(zhì)濃縮，出現(xiàn)了不對(duì)稱的質(zhì)壁分離，且喪失了FDA染色活性。這些結(jié)果表明由高濃度細(xì)胞分裂素處理引起的棉花懸浮細(xì)胞大規(guī)模死亡也是一種PCD。這與Carimi等(2003)在胡蘿卜和擬南芥懸浮細(xì)胞中觀察到的現(xiàn)象一致。不同的生理狀態(tài)(UCSA和BAE)和不同生長(zhǎng)時(shí)期(指數(shù)增長(zhǎng)期和靜止期)的棉花懸浮細(xì)胞對(duì)高濃度細(xì)胞分裂素的誘導(dǎo)反應(yīng)表現(xiàn)出差異。UCSA狀態(tài)的懸浮細(xì)胞對(duì)高濃度細(xì)胞分裂素更

11、敏感，而BAE狀態(tài)的棉花懸浮細(xì)胞對(duì)高濃度細(xì)胞分裂素的敏感性則較弱。指數(shù)增長(zhǎng)期的UCSA棉花懸浮細(xì)胞比靜止期的UCSA棉花懸浮細(xì)胞對(duì)高濃度的細(xì)胞分裂素更敏感。研究還發(fā)現(xiàn)，激素間的相互作用對(duì)高濃度細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的PCD也會(huì)產(chǎn)生影響：2，4-D對(duì)由高濃度細(xì)胞分裂素誘導(dǎo)的細(xì)胞程序性死亡起抑制作用，而ABA則不能。 黃萎病菌分泌的毒素是導(dǎo)致黃萎病的關(guān)鍵生化因子。用26μg/mlT9和V天門的粗毒素分別處理鄂抗9和珂字201懸浮細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，都

12、能誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，但通過死亡曲線的比較發(fā)現(xiàn)：V天門的粗毒素處理鄂抗9懸浮細(xì)胞后的死亡進(jìn)程與其他處理的不同，其細(xì)胞死亡發(fā)生得更早更快。經(jīng)過抽提基因組DNA進(jìn)行電泳分析發(fā)現(xiàn)：僅V天門的粗毒素處理鄂抗9的組合中有DNALadder出現(xiàn)。對(duì)這一現(xiàn)象的合理解釋就是在V天門中可能存在與鄂抗9的抗性基因(R)相對(duì)應(yīng)的無毒基因(avr)，而在T9中不存在與鄂抗9的抗性基因(R)相對(duì)應(yīng)的無毒基因(avr)。因此，V天門的粗毒素能引起鄂抗9懸浮細(xì)胞的HR，T