程序性細胞死亡與沉香倍半萜次生代謝關系的探索研究.pdf

1、國產沉香為瑞香科白木香Aquilaria sinensis(Lour.) Gilg含樹脂的木材，為著名的芳香南藥，同時在香料、化工、宗教、工藝品等有廣泛應用。白木香野生資源主要分布于海南、廣東、廣西、云南、福建等地。因伐樹結香，目前白木香的野生資源幾乎破壞殆盡，1999年被列為國家二級保護植物，2000年被列入《世界自然保護聯(lián)盟受威脅植物紅色名錄》，2004年已被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》(CITES)附錄Ⅱ。目前中國已種植的

2、白木香林超過3000萬株，迫切需要高效的結香技術。近年來，魏建和團隊發(fā)明的“通體結香”技術已開始在國內外廣泛應用，并獲得了較好的結香效果。傷害誘導白木香防御反應形成沉香的機制已得到初步揭示，但沉香形成的機制，特別是初始傷害后沉香持續(xù)形成的分子機制尚未清晰闡明，制約了通體結香技術的改進及更優(yōu)方法的發(fā)明。本論文首次較系統(tǒng)地研究了程序性細胞死亡(PCD，programmed cell death)與沉香倍半萜形成的關系，以探索PCD與沉香形成

3、，特別是持續(xù)結香的關系。
　　1、構建了體系均一穩(wěn)定、細胞活力良好的白木香懸浮細胞體系，健康體系未檢測到倍半萜α-愈創(chuàng)木烯(α-guaiene)、α-蛇麻烯(α-humulene)和δ-愈創(chuàng)木烯(δ-guaiene)，但MeJA可誘導其產生倍半萜，表明懸浮細胞體系可作為結香機制研究的離體材料。采用莖尖誘導愈傷組織，最適培養(yǎng)基為MS+2.0 mg·L-1 NAA+1.0mg·L-16-BA;經12次繼代培養(yǎng)的愈傷組織生長旺盛、質地疏

4、松適于懸浮培養(yǎng);將其置于液體培養(yǎng)基MS+2.0 mg·L-1 NAA+1.0 mg·L-16-BA+500.0 mg·L-1 CH中震蕩培養(yǎng)，建成懸浮細胞體系。懸浮細胞生長曲線呈S型，初期增長緩慢，4-6 d為對數(shù)增長期，7-12d進入平臺期，12d以后細胞生長速度及活力下降;GC-MS分析結果顯示，培養(yǎng)0d、3d、6d、12d懸浮細胞未檢測到倍半萜α-guaiene、α-humulene、δ-guaiene，使用100μM MeJA處

5、理24 h可明顯檢測到這三種倍半萜。PCD檢測結果表明，懸浮細胞培養(yǎng)到24 d后發(fā)生PCD;熒光定量PCR檢測倍半萜誘導結果表明，懸浮培養(yǎng)到24 d后倍半萜合成相關基因表達明顯提高，說明生長后期的懸浮細胞不可用于結香機制研究。因此，本實驗所構建的白木香懸浮細胞體系在7-12d可作為研究傷害誘導白木香防御反應形成沉香機制的離體材料。
　　2、首次克隆了沉香倍半萜合成途徑的AsAACT、 AsHMGS、AsHDR及AsDXR4個基因全

6、長，為檢測倍半萜合成提供參考指標。本課題對沉香倍半萜合成的4個關鍵酶基因AsAACT、AsHMGS、AsDXR、AsHDR進行全長克隆、生物信息學分析。運用熒光定量PCR對茉莉酸甲酯MeJA及水楊酸SA誘導白木香懸浮細胞的關鍵基因AsAACT、AsHMGS、AsHMGR、AsDXS、AsDXR、AsHDR、AsFPS、ASS1及ASS2表達進行分析，運用基因表達譜對火烙法、接菌法與輸液法處理的白木香轉錄組數(shù)據進行分析，最終篩選到AsAA

7、CT、AsFPS、ASS1、ASS2為特異表達基因，可作為后續(xù)實驗檢測誘導型倍半萜的參考指標。
　　3、H2O2脅迫可以明顯誘導白木香懸浮細胞PCD，生成少量的α-guaiene、α-humulene、δ-guaiene。H2O2處理后3h發(fā)生PCD，6-12h出現(xiàn)明顯的細胞核皺縮及DNA降解，24 h MCP1、MCP2、Cyt-c表達明顯調高，48 h細胞核變?yōu)楹诵◇w;采用GC-MS檢測、峰面積歸一化法計算，得出三種倍半萜的相

8、對百分含量，H2O2處理后3h僅檢測到0.058％α-humulene，6 hFPS、ASS1、ASS2表達明顯上調，12h可檢測到0.244％α-humulene與0.521％δ-guaiene，24 h可檢測到0.157％α-guaiene、0.373％α-humulene、1.297％δ-guaiene。
　　4、MeJA也可以明顯誘導白木香懸浮細胞發(fā)生PCD，生成較大量的α-guaiene、α-humulene、δ-gua

9、iene。(1)采用2.5μM～25μM MeJA處理懸浮細胞，96 h內細胞死亡率無明顯變化，但采用TUNEL法可檢測到陽性細胞，說明懸浮細胞發(fā)生了PCD但尚未死亡;MeJA處理后12h，三種倍半萜總量最高，2.5μM和25μM MeJA處理分別達86.098％、71.825％，之后倍半萜量下降，48 h分別下降到31.993％、20.908％;(2)采用50μM～100μM MeJA處理，12h～96h細胞死亡率顯著升高，TUNEL

10、檢測處理后懸浮細胞3h～6h呈弱陽性、24 h～96 h呈陽性;三種倍半萜總量在12 h～24 h最高，50μM和100μM MeJA處理分別達93.884％、89.037％，之后總量一直保持在71％以上;(3)采用250μM～500μM MeJA處理，在12 h～96 h細胞死亡率顯著升高，TUNEL檢測處理后懸浮細胞3h呈弱陽性、96 h呈陽性;三種倍半萜總量在24 h最高，250μM和500μM MeJA處理分別達90.197％、

11、76.335％，之后總量一直保持在58％以上;(4)相關性分析表明，細胞死亡率與倍半萜濃度呈顯著正相關，說明MeJA處理后懸浮細胞發(fā)生的PCD很可能由倍半萜誘導;(5)Caspase抑制劑Z-VAD-FMK可一定程度減緩懸浮細胞發(fā)生PCD的進程，但不能阻止，對倍半萜合成關鍵基因有下調趨勢，反向證明PCD對倍半萜具有正向促進作用。
　　5、愈創(chuàng)木烯型倍半萜guaiene及α-humulene能誘導白木香懸浮細胞的PCD，說明初始傷害

12、后誘導白木香懸浮細胞生成的倍半萜可能會產生類似二次傷害的作用，進一步推動PCD的發(fā)生。guaiene、α-humulene處理健康的白木香懸浮細胞，可檢測到PCD，guaiene比α-humulene更容易誘導PCD;隨著倍半萜濃度增加、處理時間延長，細胞死亡率升高，TUNEL的熒光強度增大、PCD關鍵基因的表達上調。
　　本研究采用白木香懸浮細胞體系探索了程序性細胞死亡與沉香倍半萜的關系。通過研究初步闡明傷害脅迫H2O2及MeJ