栗疫病菌程序性細(xì)胞死亡與相關(guān)基因功能研究.pdf

1、栗疫病菌是栗樹上毀滅性的病害之一，其引起栗樹枝干潰瘍病是栗生產(chǎn)上的病害之一。由于栗疫病菌難以防治，普通的化學(xué)防治比較困難。栗疫病菌的細(xì)胞死亡與相關(guān)基因的研究，可以為尋找新的殺菌劑靶標(biāo)，設(shè)計(jì)新的病害控制策略提供理論指導(dǎo)。
　　 營養(yǎng)體不親和性誘導(dǎo)栗疫病菌菌株間程序性細(xì)胞死亡為了驗(yàn)證營養(yǎng)體不親和性導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的特征，主要進(jìn)行了融合細(xì)胞基因組DNA降解的瓊脂糖電泳檢測(cè)，細(xì)胞學(xué)研究主要是細(xì)胞核變化的染色，活性氧產(chǎn)生的測(cè)定，脂肪粒染色以及

2、融合細(xì)胞的死活檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明混合孢子涂板基因組DNA降解瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)DNA梯狀條帶，這一結(jié)果為營養(yǎng)體不親和性誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡提供了新的證據(jù)，細(xì)胞學(xué)研究觀察到細(xì)胞核的降解，活性氧的變化以及脂肪粒的積累，融合細(xì)胞的死亡，與凋亡類細(xì)胞死亡相似。
　　 外源過氧化氫對(duì)栗疫病菌低毒力菌株EP713四種抗氧化酶的影響用外源的氧化壓力模擬寄主的氧迸發(fā)影響，用10mM過氧化氫處理低毒力菌株EP713與野生型菌株EP155不同時(shí)間取樣，測(cè)

3、定處理菌絲的四種抗氧化酶活性，結(jié)果表明EP155與EP713的四種抗氧化酶的活性達(dá)最大值時(shí)的活性有差異，但谷胱甘肽還原酶與谷胱甘肽過氧化物酶出現(xiàn)最大值的時(shí)間野生型菌株比低毒力菌株較晚，活性較高。說明低毒力病毒對(duì)栗疫病菌抗氧化能力可能有影響。
　　 過氧化氫誘導(dǎo)栗疫病菌分生孢子細(xì)胞死亡對(duì)外源氧化壓力誘導(dǎo)栗疫病菌分生孢子的細(xì)胞死亡進(jìn)行了研究。過氧化氫亞致死與致死濃度為10 mM與150 mM;對(duì)過氧化氫影響分生孢子萌發(fā)的時(shí)間效應(yīng)進(jìn)行

4、了分析和細(xì)胞學(xué)研究，細(xì)胞學(xué)主要觀察細(xì)胞核的變化，活性氧與一氧化氮的產(chǎn)生，以及電泳檢測(cè)DNA降解，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外源的氧化壓力引起細(xì)胞核的變化，活性氧隨處理時(shí)間增長不斷增多，一氧化氮產(chǎn)生主要是150 mM處理30 min，電泳結(jié)果沒有檢測(cè)到DNA梯狀條帶，表明外源的氧化壓力誘導(dǎo)栗疫病菌分生孢子的細(xì)胞死亡，這種細(xì)胞死亡細(xì)胞核發(fā)生降解，且這種細(xì)胞死亡與活性氧和一氧化氮的產(chǎn)生相關(guān)。
　　 栗疫病菌核糖基化因子1(ARF1)基因功能的表型效

5、應(yīng)在COGEME數(shù)據(jù)庫栗疫病菌EST中搜索到CpARF1，克隆了CpARF1全長，并進(jìn)行了聚類分析與同源性比較，該基因具有保守的高爾基體結(jié)合的結(jié)構(gòu)域MXXE;利用轉(zhuǎn)錄基因沉默技術(shù)研究了該基因在栗疫病菌中的功能，沉默突變體表現(xiàn)出對(duì)硫酸銅與氟化鈉的敏感，漆酶產(chǎn)生減少，無性孢子產(chǎn)生減少或不產(chǎn)生，并且導(dǎo)致致病性減弱。結(jié)果表明栗疫病菌CpARF1可能影響栗疫病菌對(duì)硫酸銅與氟化鈉的敏感性，漆酶產(chǎn)生，無性繁殖以及致病性。
　　 栗疫病菌泛素核

6、糖體L40融合蛋白基因功能的表型效應(yīng)在COGEME數(shù)據(jù)庫栗疫病菌EST中搜索到Cp UFP，克隆并分析了栗疫病菌中泛素融合蛋白Cp UFP。該基因氨基酸含有典型的結(jié)合泛素結(jié)合酶的結(jié)構(gòu)域，系統(tǒng)進(jìn)化上與其它絲狀子囊菌的親緣關(guān)系較近。利用轉(zhuǎn)錄基因沉默技術(shù)研究了該基因在栗疫病菌中的功能，沉默突變體表現(xiàn)出對(duì)過氧化氫與氯化鈉的敏感，漆酶的產(chǎn)生減少，無性孢子產(chǎn)生減少或不產(chǎn)生，并且導(dǎo)致致病性減弱。結(jié)果表明Cp UFP基因可能影響栗疫病菌對(duì)過氧化氫與氯化