柑橘黃化脈明病毒誘導(dǎo)尤力克檸檬細(xì)胞程序性死亡研究.pdf

1、柑橘黃脈病是柑橘黃化脈明病毒（Citrusyellow vein clearing virus，CYVCV）引起的一種新型柑橘病害，嚴(yán)重威脅檸檬和酸橙產(chǎn)業(yè)，主要造成葉片脈明和黃化。目前該病在我國重慶、四川等地相繼爆發(fā)，尤其以四川安岳檸檬產(chǎn)區(qū)為害最為嚴(yán)重。研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞程序性死亡（programmed cell death，PCD）與植物抗病過程密切相關(guān)。植物抵抗病原物入侵時產(chǎn)生的過敏性反應(yīng)（hypersensitive reaction，

2、HR）是植物抗病的的重要手段之一，也是PCD的一種表現(xiàn)。本研究以健康尤力克檸檬為試材，采用嫁接傳毒的方法，通過對CYVCV侵染后不同時期尤力克檸檬病毒含量、PCD相關(guān)基因、代謝酶活性進(jìn)行測定，并結(jié)合TUNEL原位末端標(biāo)記、電子顯微鏡、瓊脂糖凝膠電泳等方法對 PCD進(jìn)行檢測，從而了解CYVCV誘導(dǎo)柑橘細(xì)胞程序性死亡機(jī)制。主要研究結(jié)果如下：
　　1、通過DTBIA與免疫熒光技術(shù)確定CYVCV在尤力克檸檬葉片主脈的韌皮部、分泌腔周圍以及

3、薄壁細(xì)胞中發(fā)生。
　　2、TUNEL技術(shù)檢測結(jié)果表明：在感病初期，隨著感病時間的增加，尤力克檸檬葉片出現(xiàn)PCD陽性反應(yīng)，并隨著CYVCV含量的增加而不斷加強(qiáng)；而在感病后期CYVCV含量降低，PCD陽性反應(yīng)減少。因此推測CYVCV可以誘導(dǎo)尤力克檸檬PCD的產(chǎn)生，同時PCD陽性反應(yīng)隨CYVCV含量的增加不斷增多。
　　3、CYVCV脅迫下，尤力克檸檬根、莖、葉都出現(xiàn)不同程度的PCD陽性反應(yīng)，由強(qiáng)到弱依次為根、莖、葉，與 CYVC

4、V含量分布相一致。因此推測 CYVCV含量的增加可以促進(jìn)尤力克檸檬葉片PCD的產(chǎn)生。
　　4、CYVCV誘導(dǎo)尤力克檸檬葉片超微結(jié)構(gòu)變化：（1）葉綠體淀粉粒增多，嗜鋨顆粒增多且體積變大，葉綠體腫脹、畸形，病變嚴(yán)重的葉綠體出現(xiàn)解體現(xiàn)象。（2）少量線粒體出現(xiàn)外膜溶解、嵴突模糊、解體等現(xiàn)象。（3）細(xì)胞核出現(xiàn)染色質(zhì)凝聚且邊緣化，核膜溶解，核質(zhì)高度濃縮等典型PCD現(xiàn)象。進(jìn)一步證明PCD可以誘導(dǎo)柑橘細(xì)胞程序性死亡。
　　5、通過實(shí)時熒光定

5、量PCR檢測CYVCV脅迫下尤力克檸檬不同時期PCD相關(guān)基因CsCysp、Cit-Dad1-1和MCA1的表達(dá)，結(jié)果顯示，CsCysp、Cit-Dad1-1基因表達(dá)量下調(diào)，MCA1基因表達(dá)量上調(diào)，從而促進(jìn)PCD的產(chǎn)生。
　　6、CYVCV侵染后，感病組織 caspase-3蛋白酶活性隨感病時間的增加而增加；丙二醛含量呈先下降后上升趨勢，且高于對照組，表明細(xì)胞膜脂過氧化作用增加；感病前期細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT、POD酶活性總體呈下降趨