芹菜胚性細胞懸浮系的建立及原生質(zhì)體培養(yǎng)研究.pdf

1、芹菜(ApiumgraveolensL)屬傘形科，原產(chǎn)地中海沿岸，我國栽培歷史悠久，各地均有種植。建立芹菜的離體培養(yǎng)再生體系和胚性細胞懸浮系為以后的原生質(zhì)體培養(yǎng)、融合、突變體的篩選和遺傳轉(zhuǎn)化打下基礎(chǔ)，本文取得的主要研究結(jié)果有以下幾方面： 1通過對芹菜離體培養(yǎng)過程中激素配比、外植體、基因型及植株再生等條件的研究，建立了芹菜高頻植株再生體系。研究結(jié)果認為：芹菜下胚軸最適于誘導(dǎo)愈傷組織，其愈傷組織誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基是MS+2，4-D1m

2、g/L+KT1mg/L，繼代培養(yǎng)和胚狀體誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基分別為MS+2，4-D0.5mg/L+KT0.5mg/L+4％甘露醇+CH500mg/L和MS+CH500mg/L+2，4-D1mg/L；基因型對愈傷組織和胚狀體的誘導(dǎo)影響很大；愈傷組織在繼代培養(yǎng)基上可以從非胚性狀態(tài)向半胚性和胚性狀態(tài)轉(zhuǎn)化。在無激素的MS或1/2MS固體培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)不定芽，可以生根并獲得了芹菜的完整再生植株。再生植株經(jīng)馴化后，將其移栽入裝有營養(yǎng)土的營養(yǎng)缽中，成活

3、率95％以上。 2將胚性愈傷組織接種于與繼代培養(yǎng)基成分相同但不加瓊脂的MS液體培養(yǎng)基進行懸浮培養(yǎng)，經(jīng)過3-5次繼代后可形成增殖迅速、分散度良好的具有較高的體細胞胚分化能力的芹菜胚性細胞懸浮系。芹菜細胞懸浮系的生長周期為20天左右，以干重為生長指標，得到的細胞增殖曲線呈“S”形。接種量對懸浮細胞的生長影響較大：最佳接種量為0.8克/40ml懸浮液。懸浮液的PH值呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢；MAD含量呈現(xiàn)不對稱的“M”形變化，這些變化都

4、與生長曲線變化趨勢相關(guān)。不同品種間胚性細胞懸浮系的生長能力不同。懸浮系愈傷組織的分化能力低于其對應(yīng)的胚性愈傷組織分化能力。懸浮細胞團轉(zhuǎn)入1/2MS+500mg/LCH+0.25mg/LKT固體分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)出不定芽，30天后再轉(zhuǎn)入MS基本培養(yǎng)基，獲得完整的再生植株。 3利用芹菜胚性細胞懸浮系成功分離得到大量原生質(zhì)體，其中酶種類和濃度、酶解時間、懸浮細胞培養(yǎng)時間、滲透壓調(diào)節(jié)劑對分離原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力有重要影響。獲得芹菜大量原生質(zhì)

5、體的最佳反應(yīng)體系為：所需酶液組成為3.0％纖維素酶OnozukaR-10、1.0％離析酶macerozymeR-10、11％甘露醇、0.5％CaCl2和0.1％MES；搖床轉(zhuǎn)速為80rpm，酶解時間5-6小時；甘露醇作滲透壓穩(wěn)定劑，原生質(zhì)體產(chǎn)量為2.50×107g-1，原生質(zhì)體活力83.41％。原生質(zhì)體淺層培養(yǎng)，基本培養(yǎng)基為1/2MS或DU，兩天后，重新再生細胞壁并進行第一次分裂，逐步降低滲透壓至甘露醇3％，大約30天形成小愈傷組織。在

6、1/2MS+1mg/L2，4-D+0.5mg/LKT+11％甘露醇+500mg/L水解絡(luò)蛋白經(jīng)增殖培養(yǎng)后在1/2MS+500mg/LCH+0.25mg/LKT固體分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)出不定芽，30天后再轉(zhuǎn)入MS基本培養(yǎng)基，獲得完整的再生植株。 4褐化問題存在于芹菜離體培養(yǎng)的各個階段，通過對外植體類型及其大小、基本培養(yǎng)基及培養(yǎng)方法、吸附劑和抗氧化劑對控制褐化的影響研究，認為：0.5-0.8cm下胚軸在初代愈傷組織誘導(dǎo)中不易褐化，MS基本