對(duì)蝦白斑綜合征病毒細(xì)菌人工染色體基因組的構(gòu)建研究.pdf

1、上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 學(xué) 校 代 碼 ： 1 0 2 6 4研究生學(xué)號(hào)： M100208351上 海 海 洋 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 文 題 目： 目：對(duì)蝦白斑綜合征病毒細(xì)菌人工染色體基因組 對(duì)蝦白斑綜合征病毒細(xì)菌人工染色體基因組 的構(gòu)建研究 的構(gòu)建研究 英文題目： 英文題目：Cloning the genomic DNA of white spot syndrome virus as bact

2、erial artificial chromosome 專 業(yè)： 業(yè)：食品科學(xué)與工程 食品科學(xué)與工程 研究方向： 研究方向：分子病毒學(xué) 分子病毒學(xué) 姓 名： 名：馮博 馮博 指導(dǎo)教師： 指導(dǎo)教師：王永杰 王永杰 教授 教授 二〇一三年四月十日 二〇一三年四月十日 上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文 對(duì)蝦白斑綜合征病毒細(xì)菌人工染色體基因組的構(gòu)建研究 摘 要 對(duì)蝦白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus, W

3、SSV)是對(duì)蝦最主要的病原體之一， 可在短時(shí)間內(nèi)造成對(duì)蝦大規(guī)模的死亡。 自上世紀(jì)九十年代初在臺(tái)灣北部發(fā)現(xiàn)以來， WSSV 已經(jīng)擴(kuò)散至世界各地， 對(duì)全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。 由于缺乏連續(xù)培養(yǎng) WSSV 的細(xì)胞株及其基因組 DNA 體外克隆操作系統(tǒng)，WSSV 病毒學(xué)特性的研究進(jìn)展緩慢。本研究嘗試著通過構(gòu)建 WSSV 的細(xì)菌人工染色體基因組 DNA (WSSV::BAC)，建立病毒基因組 DNA 體外克隆系統(tǒng)，為研究病毒基因的功能

4、， 特別是在病毒經(jīng)口侵染對(duì)蝦過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用的蛋白功能提供一個(gè)思路。WSSV::BAC 的構(gòu)建基于含有 mini-F 因子的轉(zhuǎn)座子。通過體外轉(zhuǎn)座反應(yīng)插入到 WSSV 基因組 DNA 后，使得病毒基因組 DNA 可以在大腸桿菌中以單拷貝的形式復(fù)制。同時(shí)，轉(zhuǎn)座子還攜帶有氯霉素抗性基因。經(jīng)含有氯霉素的選擇性培養(yǎng)基初步篩選之后，再通過 WSSV 特異性 PCR 擴(kuò)增和菌落原位雜交相結(jié)合的方法進(jìn)一步篩選，以期獲得含有 WSSV::BAC 的陽性

5、克隆。 為了解決因病毒基因組過大可能會(huì)導(dǎo)致克隆成功率過低的問題， 本文①采用了電轉(zhuǎn)化的方式，②以可接收外源大片段 DNA 的電轉(zhuǎn)化感受態(tài) E. coli DH10B為受體細(xì)胞，③增加了轉(zhuǎn)座反應(yīng)體系中 WSSV 基因組 DNA 和轉(zhuǎn)座子的摩爾數(shù)，④降低了轉(zhuǎn)座反應(yīng)體系中離子濃度，⑤延長了電擊時(shí)間。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)座成功率得到提高，并獲得了較多的陽性克隆子。 研究中以 WSSV vp26 基因?yàn)榘袠?biāo)設(shè)計(jì)了 WSSV 特異性的引物和探針。 通過菌落

6、 PCR 和菌落原位雜交技術(shù)， 篩選含有 WSSV::BAC 的陽性克隆子。 菌落 PCR結(jié)果表明，在篩選的 1452 個(gè)克隆中，部分克隆傳代前可以獲得陽性信號(hào)，傳代后卻檢測(cè)不到陽性信號(hào)，同時(shí)也提取不到 WSSV::BAC。菌落原位雜交結(jié)果初步表明，在已篩選的 400 個(gè)克隆中，尚未找到穩(wěn)定的陽性克隆。 本文的研究雖未獲得可穩(wěn)定遺傳的 WSSV::BAC，但通過后續(xù)深入的分析和進(jìn)一步的研究，有望構(gòu)建出對(duì)蝦白斑綜合征病毒的細(xì)菌人工染色體基