Cq-GABARAP在對蝦白斑綜合征病毒感染中的功能研究.pdf

1、白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是對蝦和其它水產(chǎn)甲殼類動物的重要病原體，該病毒傳染能力強、致死率極高，給全球不同蝦類養(yǎng)殖業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。到目前為止鑒于缺少可用于WSSV感染增殖的對蝦細(xì)胞系，我們對于WSSV致病機(jī)理的很多科學(xué)問題仍知之甚少。
　　最近建立培養(yǎng)的螯蝦造血組織(Hematopoietic tissue，Hpt)細(xì)胞是一種研究WSSV感染的理想細(xì)胞，本研究以紅螯螯蝦（Ch

2、erax quadricarinatus）Hpt細(xì)胞為研究模型，利用細(xì)胞免疫熒光、RNA干擾、抗體轉(zhuǎn)染和重組表達(dá)蛋白功能鑒定等技術(shù)探究了紅螯螯蝦伽馬氨基丁酸受體相關(guān)蛋白(γ-aminobutyric acidreceptor-associated protein，Cq-GABARAP)在WSSV感染中的重要作用，并初步探討了Cq-GABARAP是否通過自噬調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路及Rac1信號通路影響WSSV入胞。取得成果具體如下:

3、
　　1.使用亞細(xì)胞蛋白質(zhì)組抽提試劑盒及細(xì)胞免疫熒光的方法對Cq-GABARAP蛋白進(jìn)行了亞細(xì)胞定位并發(fā)現(xiàn)在WSSV感染早期Cq-GABARAP與WSSV存在共定位;通過RNA干擾和抗體轉(zhuǎn)染技術(shù)敲降或封阻Cq-GABARAP蛋白后發(fā)現(xiàn)WSSV入胞減少，證明Cq-GABARAP參與WSSV入胞感染;添加重組表達(dá)的Cq-GABARAP蛋白后WSSV入胞增多，但抑制了病毒早期的轉(zhuǎn)錄復(fù)制，說明Cq-GABARAP可能在WSSV感染細(xì)胞的不

4、同時期發(fā)揮多功能作用。
　　2.為闡明Cq-GABARAP是否依賴于自噬調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路影響WSSV入胞，我們首先基因克隆獲得紅螯螯蝦Cq-PI3Kcα、Cq-PI3Kcδ和Cq-Akt基因序列:Cq-PI3Kcα完整開放閱讀框（Open reading frame，ORF）為3138 bp，編碼1045個氨基酸殘基;Cq-PI3Kcδ完整ORF為3192 bp，編碼1072個氨基酸殘基;Cq-Akt完整ORF為155

5、7 bp，編碼518個氨基酸殘基。使用化學(xué)抑制劑LY294002抑制Cq-PI3K蛋白活性或使用Akt inhibitor抑制Cq-Akt蛋白活性后發(fā)現(xiàn)WSSV入胞增多，但Cq-GABARAP蛋白含量沒有發(fā)生變化，結(jié)果提示PI3K-Akt信號通路參與WSSV入胞調(diào)控，但與Cq-GABARAP無關(guān)。
　　3.為解析Cq-GABARAP是否通過調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)吞活性來影響WSSV入胞，我們克隆獲得了GABARAP調(diào)控內(nèi)吞下游信號通路中的紅螯

6、螯蝦Rac1(Cq-Rac1)基因（GenBank登錄號:KP765446）。Cq-Rac1完整ORF為588 bp，編碼195個氨基酸殘基，具有保守的RHO結(jié)構(gòu)域。使用化學(xué)抑制劑和RNA干擾技術(shù)抑制或敲降Cq-Rac1蛋白活性后WSSV入胞增多，且轉(zhuǎn)染重組表達(dá)的Cq-Rac1蛋白后WSSV入胞顯著減少，說明Cq-Rac1負(fù)調(diào)控WSSV入胞。此外RNA干擾敲降Cq-Rac1可進(jìn)一步增強Cq-GABARAP介導(dǎo)的WSSV入胞促進(jìn)作用，表明