對蝦白斑綜合征病毒(White Spot Syndrome Virus,WSSV)入胞途徑及其分子調(diào)控機制研究.pdf

1、白斑綜合征病毒(White spot syndrome virus，WSSV)是對蝦的主要病原，該病毒致死率高、傳染性強、宿主范圍廣，是水生甲殼類動物中最為嚴(yán)重的病毒性病原之一。因此，加深對WSSV感染致病機理的理解，尋找高效抗病毒防治方法，意義重大。培養(yǎng)細(xì)胞是病毒感染研究的有力工具，在甲殼動物原代細(xì)胞培養(yǎng)研究中，螯蝦造血組織干細(xì)胞(Haematopoietic tissue stem cell，Hpt cell)—Hpt細(xì)胞培養(yǎng)較為穩(wěn)

2、定，是WSSV感染研究的首選。本研究以紅螯螯蝦(Cheraxquadricarinatus)為研究對象，參照SOderh(a)ll等的研究方法培養(yǎng)紅螯螯蝦Hpt細(xì)胞，分析WSSV在Hpt細(xì)胞中的感染特性，篩選Hpt細(xì)胞感染W(wǎng)SSV后的差異表達(dá)基因，從分子生物學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)角度探討WSSV入胞及其分子調(diào)控機制以及宿主細(xì)胞抵御WSSV感染機制。
　　利用分子生物學(xué)技術(shù)檢測WSSV基因表達(dá)，結(jié)合共聚焦顯微鏡分析WSSV感染Hpt細(xì)胞的過

3、程，結(jié)果顯示W(wǎng)SSV可在15 min內(nèi)粘附或進(jìn)入Hpt細(xì)胞，其中可能涉及病毒囊膜與細(xì)胞膜融合入胞過程;感染后1h和3h，IE1和VP28分別開始轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表達(dá)量持續(xù)升高至96 hpi。此外，單病毒粒子成像研究揭示W(wǎng)SSV感染細(xì)胞僅占總Hpt細(xì)胞的10-15％，提示W(wǎng)SSV對不同類型Hpt細(xì)胞可能具有不同嗜性。
　　為探究WSSV感染Hpt細(xì)胞分子機制，我們采用抑制性消減雜交技術(shù)(Suppression subtractive hy

4、bridization，SSH)分析紅螯螯蝦Hpt細(xì)胞感染W(wǎng)SSV后不同時間(感染極早期1 hpi和感染晚期12 hpi)的基因差異表達(dá)。經(jīng)點雜交篩選、序列測定及生物信息學(xué)分析共篩選獲得了366個病毒感染相關(guān)差異表達(dá)基因，其中包括網(wǎng)格蛋白輕鏈基因(Cq-CLC)和伽馬氨基丁酸受體相關(guān)蛋白(Cq-GABARAP)，為深入研究內(nèi)吞和自噬等相關(guān)活動在WSSV入侵宿主細(xì)胞中的作用奠定基礎(chǔ)。
　　細(xì)胞內(nèi)吞作用是多數(shù)病毒侵入宿主細(xì)胞的主要途徑

5、。為研究WSSV入侵Hpt細(xì)胞的途徑，我們利用透射電鏡觀察WSSV入胞過程，結(jié)果顯示W(wǎng)SSV可以利用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞(Clathrin-mediated endocytosis，CME)和巨胞飲入侵Hpt細(xì)胞;進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，利用CPZ和dynasore抑制CME可以明顯抑制WSSV的入胞和復(fù)制，利用EIPA和rottlerin抑制巨胞飲、利用MβCD和filipin抑制膜穴樣凹陷介導(dǎo)的內(nèi)吞也起到了類似作用，說明WSSV可以利用上述三

6、種內(nèi)吞方式進(jìn)入宿主細(xì)胞。進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)抑制Cq-CLC和Cq-AP50等參與CME過程的關(guān)鍵因子，揭示CME是WSSV入侵宿主細(xì)胞的關(guān)鍵途徑。
　　克隆獲得Cq-GABARAP的cDNA序列，進(jìn)一步探討其介導(dǎo)的WSSV入胞機制。RNAi或添加重組表達(dá)Cq-GABARAP蛋白后病毒感染試驗表明Cq-GABARAP可以促進(jìn)WSSV入胞，CPZ阻斷CME下游通路能夠抑制Cq-GABARAP的促進(jìn)作用，表明Cq-GABARAP可能

7、通過調(diào)節(jié)CME上游信號通路以促進(jìn)WSSV入胞;此外，蛋白互作試驗發(fā)現(xiàn)，Cq-GABARAP可與包括VP28在內(nèi)的多個WSSV囊膜蛋白結(jié)合，提示Cq-GABARAP與病毒粒子直接結(jié)合可能是其促進(jìn)WSSV入胞的另一機制;電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，病毒感染早期WSSV可與自噬小體共定位，自噬調(diào)節(jié)制劑改變了Hpt細(xì)胞自噬活性、進(jìn)而影響了WSSV入侵Hpt細(xì)胞，表明自噬可能參與內(nèi)吞活動從而調(diào)節(jié)WSSV入胞。
　　此外，本研究還發(fā)現(xiàn)Cq-GABARAP具

8、有抗WSSV功能?；虮磉_(dá)差異分析顯示Hpt細(xì)胞中Cq-GABARAP在感染W(wǎng)SSV后表達(dá)上調(diào)，RNAi或重組表達(dá)蛋白孵育后感染病毒試驗揭示Cq-GABARAP是一個抗WSSV因子，免疫印跡和電鏡觀察試驗揭示Cq-GABARAP可促進(jìn)Hpt細(xì)胞攝入WSSV，并匯聚入胞病毒粒子成團，抑制病毒粒子入核啟動復(fù)制，從而發(fā)揮抗WSSV作用;雷帕霉素誘導(dǎo)自噬活性增強后，Hpt細(xì)胞內(nèi)WSSV復(fù)制受到抑制，說明自噬可能是一種重要的抗WSSV防御反應(yīng)。<