對(duì)蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP110的表達(dá)純化研究.pdf

1、本文通過(guò)對(duì) WSSV囊膜 VP110序列進(jìn)行 blast和alignment分析后發(fā)現(xiàn)，vp110和pif2有相似性，而pif2是桿狀病毒經(jīng)口侵染因子。進(jìn)一步序列分析發(fā)現(xiàn)，VP110和PIF2均在N端有高疏水性區(qū)域，且為跨膜區(qū)。我們將WSSV VP110與昆蟲DNA病毒Baculoviruses、Nudiviruses、Hytrosaviruses等的PIF2蛋白序列最相似的，不包含疏水性較高的N端區(qū)域的150到600aa定義為sVP1

2、10，將其基因序列克隆到pET-16b表達(dá)載體上。對(duì)表達(dá)條件如溫度、時(shí)間、誘導(dǎo)劑濃度和誘導(dǎo)時(shí)間進(jìn)行優(yōu)化，高表達(dá)無(wú)斷裂的融合蛋白 sVP110-His，經(jīng) GE蛋白純化儀AKTA Pure系統(tǒng)純化后，蛋白純度達(dá)到80％以上。復(fù)性條件經(jīng)過(guò)不斷探索、優(yōu)化后，選擇了最佳復(fù)性條件6mol/L的尿素溶液4℃透析1 h，接著使用4mol/L尿素溶液透析4 h，最后用2mol/L尿素溶液透析2 h，成功完成透析復(fù)性。使用超濾管超濾濃縮復(fù)性成功的蛋白sV

3、P110-His，得到高濃度、高親水性的sVP110-His蛋白，濃度達(dá)到600.83 mg/mL，總量完全滿足制備兔源多克隆抗體的要求（≥3 mg）。將制備成功的融合蛋白 sVP110-His作為抗原免疫兔子，成功的制備出特異性高，親和性好的多克隆抗體，抗體的效價(jià)達(dá)到1：23,000。這為進(jìn)一步驗(yàn)證WSSV的經(jīng)口侵染以及VP110與圍食膜蛋白的相互作用打下了基礎(chǔ)。
　　我們將VP110功能區(qū)域(150aa-610aa)構(gòu)建到載體

4、pQE80-ZZtev、pET-16b、pGEX-4T1和pET-32a，經(jīng)過(guò)對(duì)原核表達(dá)的條件的摸索：如改變誘導(dǎo)溫度、嘗試低溫表達(dá)、誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)及縮短、誘導(dǎo)劑濃度的摸索（1 mmol/L、0.1 mmol/L）；嘗試不同的表達(dá)菌株BL21、Rosetta和OrigamiB；最終用N端帶有提高蛋白可溶性的硫氧還原蛋白標(biāo)簽和兩端均有用于純化的his標(biāo)簽的pET-32a載體，成功的表達(dá)出可溶性融合蛋白 sVP110-Trx，并對(duì)其進(jìn)行了純化優(yōu)

5、化摸索，得到可溶性的融合蛋白sVP110-Trx。
　　本文在研究過(guò)程中，嘗試表達(dá) VP110全長(zhǎng)蛋白。選用了不同的表達(dá)載體、不同表達(dá)菌株，并對(duì)表達(dá)條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，VP110全長(zhǎng)以包涵體形式表達(dá)。上清中含量極微或者完全檢測(cè)不到。三種表達(dá)菌株BL21、Rosetta和OrigamiB中，Rosetta的表達(dá)能力最好，BL21次之，OrigamiB最差。三株菌的最適表達(dá)條件均為1 mmol/L的IPTG和30℃的誘導(dǎo)溫度。三個(gè)