對(duì)蝦白斑綜合征病毒囊膜蛋白VP28基因的表達(dá)及其重組蛋白抗病性研究.pdf

1、對(duì)蝦白斑綜合征(WSS)是全球?qū)ξr養(yǎng)殖業(yè)所面臨的危害性最大的病害之一，至今已席卷了世界各國(guó)的對(duì)蝦養(yǎng)殖地區(qū)，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。但目前尚無(wú)有效的防治手段。因此，預(yù)防和控制疾病方面的研究正成為熱點(diǎn)。本研究主要在大腸桿菌和昆蟲(chóng)桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)了對(duì)蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP28，比較了原核表達(dá)產(chǎn)物和真核表達(dá)產(chǎn)物保護(hù)克氏原螯蝦抵抗WSS的效果。主要研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下： 1)用蔗糖墊層差速離心法從人工感染的螯蝦中分離

2、純化了WSSV。完整病毒粒子長(zhǎng)約360～420nm，直徑約80～120 nm，而核衣殼長(zhǎng)約320～400nm，直徑約80～90nm。通過(guò)對(duì)純化的WSSV進(jìn)行SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn)至少存在12個(gè)大小不同的蛋白條帶。這與報(bào)道的結(jié)果相似，說(shuō)明本研究所分離的病毒確實(shí)是WSSV。 2)利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增和克隆得到了完整的囊膜蛋白VP28基因(GenBank登錄號(hào)為DQ098011)，基因序列全長(zhǎng)為615 bp，編碼204個(gè)氨基酸。與已

3、登錄GenBank的幾個(gè)不同地理分離株的同源性均在99％以上。通過(guò)對(duì)預(yù)測(cè)的204個(gè)氨基酸進(jìn)行DNATools 5.1分析表明VP28基因序列存在多個(gè)可能的糖基化位點(diǎn)。 3)VP28基因在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá)，并用Ni-NTA柱純化后，分別用SDS-PAGE和Westemblot進(jìn)行蛋白分析。結(jié)果顯示其表達(dá)產(chǎn)物均出現(xiàn)了明顯的特異性條帶，而且大小與預(yù)測(cè)的一致，表明VP28基因在大腸桿菌中進(jìn)行了有效的融合表達(dá)。但重組得到的VP28蛋白分

4、子量比在純化病毒中分離得到的蛋白分子量小，暗示著在大腸桿菌中重組VP28蛋白得不到轉(zhuǎn)譯后的修飾。 4)為獲得與天然結(jié)構(gòu)相近的表達(dá)產(chǎn)物，本研究采用了Bac-to-Bac桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。VP28基因克隆到桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體pFastBacHTA后，經(jīng)轉(zhuǎn)座形成重組Bacmid-VP28。提取重組Bacmid-VP28：DNA轉(zhuǎn)染Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞進(jìn)行表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物分別用SDS-PAGE和Western blot進(jìn)行蛋白分析。結(jié)果表明，VP

5、28基因在昆蟲(chóng)細(xì)胞中進(jìn)行了有效的表達(dá)。重組得到的VP28蛋白分子量比理論推導(dǎo)的分子量大約6 kDa，但與在純化病毒中分離得到的蛋白分子量大小一致，這暗示著在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的重組VP28蛋白得到了轉(zhuǎn)譯后的修飾。 5)在摸索WSSV感染螯蝦的水溫條件時(shí)發(fā)現(xiàn)在18℃～28℃之間，隨著水溫的升高，死亡率也有增大的趨勢(shì)。但高水溫(30℃)能抑制WSSV 對(duì)螯蝦的侵襲。競(jìng)爭(zhēng)性PCR．分析結(jié)果表明在室溫(24±1℃)條件下WSSV的病毒拷貝

6、數(shù)從感染后12 h的10<'4>/mg迅速上升到96 h的10<'10>/mg，而在高溫(32±1℃)條件下WSSV的病毒拷貝數(shù)卻一直保持在10<'5>/mg左右。這說(shuō)明高溫并沒(méi)有清除患病螯蝦體內(nèi)的病毒粒子，而只是抑制了病毒的復(fù)制。 6)為了研究囊膜蛋白VP28的結(jié)構(gòu)是否對(duì)其抗病性產(chǎn)生影響，從大腸桿菌表達(dá)獲得的重組VP28蛋白(pET-VP28)和從昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的重組VP28蛋白(AcNPV-VP28)分別通過(guò)肌肉注射免疫螯蝦。

7、10d后注射一定濃度的WSSV進(jìn)行攻毒，然后通過(guò)記錄死亡率來(lái)評(píng)估VP28蛋白的保護(hù)效果。試驗(yàn)結(jié)果表明，AcNPV-VP28免疫的螯蝦死亡率與其對(duì)照組AcNPV相比，平均相對(duì)存活率(RPS)達(dá)89％，而pET-VP28免疫組與對(duì)照組pET-30a相比，平均RPS僅為35％。這一結(jié)果表明注射免疫重組囊膜蛋白VP28能誘導(dǎo)螯蝦產(chǎn)生抗病毒作用，而且從昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)獲得的重組VP28蛋白的抗病性要明顯好于從大腸桿菌中獲得的重組VP28蛋白。這暗示