布魯氏菌部分體內(nèi)感染因子免疫保護(hù)的研究.pdf

1、布魯氏菌病(Brucellosis)是由布魯氏菌(Brucella)引起的慢性傳染病,是目前世界上流行最廣、危害最大的人畜共患病之一,在我國(guó)被列為法定二類傳染病。布魯氏菌病嚴(yán)重威脅著人、畜健康。減毒活疫苗是當(dāng)前應(yīng)用最廣泛的布魯氏菌疫苗,有較好的免疫保護(hù)力,但存在諸如毒力易返強(qiáng)等安全問(wèn)題。滅活疫苗只能提供短暫的保護(hù)力。相比之下,亞單位疫苗組分明確,有疫苗的生產(chǎn)容易控制,且副作用小的優(yōu)點(diǎn),故具有廣闊的前景。
　　布魯氏菌毒力因子和胞內(nèi)

2、寄生機(jī)制的研究已成為國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)。研究表明,布魯氏菌基因組中許多基因與布魯氏菌生長(zhǎng)、侵襲、寄生和免疫等功能密切相關(guān),但仍有約22％的編碼基因功能不明。實(shí)驗(yàn)室的前期研究中,使用體內(nèi)誘生抗原技術(shù)(in vivo-induced antigen technology,IVIAT)篩選到33個(gè)體內(nèi)感染因子,對(duì)其中部分體內(nèi)感染因子進(jìn)行免疫保護(hù)的研究,旨在為防控布魯氏菌病篩選到更多的保護(hù)性抗原。
　　首先,選取IVIAT篩選到的體內(nèi)感

3、染基因YaeC、Asly、EcoA、MDH、SDR、Fumhy、nitrite、EnvZ、GntR、Arg和Sugar11個(gè),在大腸桿菌中表達(dá)、純化。分別擴(kuò)增11個(gè)編碼布魯氏菌體內(nèi)感染基因片段,克隆至原核表達(dá)載體pET28a(+),構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)的各重組蛋白,經(jīng)親和層析法進(jìn)行純化。
　　以MDH蛋白作為陽(yáng)性對(duì)照,對(duì)其余10種重組蛋白與纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原的結(jié)合活

4、性進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)使用已知的沒(méi)有結(jié)合活性的BSA作為陰性對(duì)照。結(jié)果表明,在11個(gè)重組蛋白與纖連蛋白和纖連蛋白溶酶原的結(jié)合活性檢測(cè),篩選到的Asly、EcoA、MDH、SDR、Fumhy、nitrite、EnvZ、Arg、Sugar9個(gè)蛋白都能與纖連蛋白及纖連蛋白溶酶原結(jié)合,推測(cè)這些蛋白可能在布魯氏菌黏附和侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮一定的作用,可能參與布魯氏菌的致病性及其在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活與增殖。
　　其次,利用獲得的重組蛋白免疫小鼠,

5、對(duì)免疫小鼠的體液免疫指標(biāo)和細(xì)胞免疫指標(biāo)分別進(jìn)行檢測(cè),以便對(duì)重組蛋白的免疫保護(hù)性進(jìn)行分析。具體是將蛋白以佐劑乳化后免疫小鼠,在免疫后不同時(shí)間分別開(kāi)展對(duì)小鼠的抗體效價(jià)的測(cè)定、外周血淋巴細(xì)胞亞型的鑒定,外周血中細(xì)胞因子含量的測(cè)定。結(jié)果,抗體檢測(cè)在二次免疫后各免疫組均能產(chǎn)生較高水平的特異性抗體。
　　對(duì)攻毒后的免疫小鼠血清中細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果表明,攻毒后Asly、nitrite和sugar蛋白免疫組血清中IFN-γ的含量極顯著的高于對(duì)照組(

6、p<0.01),而IFN-γ主要是由免疫系統(tǒng)中的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生以清除宿主細(xì)胞內(nèi)的病原,從而保護(hù)宿主免受布魯氏菌的感染。IL17A含量也有顯著高于對(duì)照組(p<0.05),IL17A含量的上升顯示出Th17細(xì)胞的活化,而Th17細(xì)胞的活化能有效的介導(dǎo)組織的炎癥反應(yīng),從而加速機(jī)體對(duì)布魯氏菌的清除與殺滅,保護(hù)機(jī)體免受感染。
　　最后,對(duì)免疫后的小鼠,用感染B.abortus2308攻毒后10天,進(jìn)行小鼠脾臟內(nèi)細(xì)菌數(shù)計(jì)數(shù),評(píng)價(jià)各重組蛋

7、白對(duì)免疫小鼠脾臟載菌量的影響。結(jié)果表明,Asly、nitrite和sugar可以保護(hù)小鼠抵抗布魯氏菌的感染,具有較好的免疫保護(hù)效果,免疫組小鼠脾臟載菌量和對(duì)照組小鼠有顯著的差別,Asly免疫組小鼠脾臟的載菌量比對(duì)照組減少2倍多,nitrite免疫組減少7倍,而sugar免疫組更是減少了14倍;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果表明,Asly和sugar免疫組的CD4+/CD8+比值要顯著低于對(duì)照組,而nitrite免疫組的CD4+/CD8+比值要顯著高