利用IVIAT篩選腸炎沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子.pdf

1、腸炎沙門菌是在全球范圍內(nèi)沙門菌感染中備受關(guān)注的血清型之一,是重要的食源性病原菌。食入被污染的肉制品(主要是禽類)及蛋制品是人類感染腸炎沙門菌的主要來源。目前腸炎沙門菌對家禽的致病機(jī)制的研究雖然取得了一定的進(jìn)展,但仍處于初級階段。雖然控制家禽腸炎沙門菌病的商品化疫苗很多,但達(dá)到完全保護(hù)力的卻沒有。因此加強(qiáng)對腸炎沙門菌致病機(jī)制、新的藥物靶點及疫苗候選株的研究顯得尤為重要。
　　 體內(nèi)誘導(dǎo)抗原技術(shù)(IVIAT)是一種利用宿主感染血清篩

2、選體內(nèi)表達(dá)的抗原基因的技術(shù),其融合了免疫學(xué)與基因組學(xué)原理和方法,鑒定出的基因可能在病原體感染宿主的過程中起重要作用,為診療技術(shù)及疫苗研發(fā)等提供新線索。
　　 1.腸炎沙門菌基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建
　　 首先,提取高純度的腸炎沙門菌CMCC50041基因組,用限制性內(nèi)切酶Sau3AⅠ對基因組進(jìn)行不完全酶切,使所得片段在0.4-2.7kb范圍內(nèi),切膠回收酶切片段。其次,用Sau3AⅠ的同尾酶BamHⅠ酶切誘導(dǎo)型表達(dá)載體pET3

3、0-a/b/c(+),再用去磷酸化酶SAP去除載體5'-末端磷酸基,沉淀回收。然后,用T4連接酶將基因組片段與處理過的載體連接,將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至高效感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH5α,并用載體特異性引物檢測片段插入效率及大小分布情況,提取質(zhì)粒保存于-70℃。結(jié)果顯示,基因組片段插入效率達(dá)到90％以上且分布均勻,所構(gòu)建的文庫的庫容量為1.68×105個克隆,可覆蓋基因組接近5次。
　　 2.利用IVIAT篩選腸炎沙門菌的體內(nèi)感染相關(guān)因

4、子
　　 制備雞抗血清,選取高滴度血清混合,分別用CMCC50041和大腸桿菌全菌、裂解上清和分泌蛋白吸附血清,然后用CMCC50041和大腸桿菌的全菌抗原、裂解上清以及CMCC50041脂多糖(LPS)進(jìn)行ELISA測定,以評價吸附效果。采用斑點免疫印跡實驗進(jìn)行IVIAT篩選,經(jīng)過初篩、SDS-PAGE及二次篩選后確定陽性克隆。最后對陽性克隆進(jìn)行測序,Blast分析確定其功能。結(jié)果顯示,篩選得到57個陽性克隆,測序比對后確定了

5、43個編碼序列,分別涉及到生物大分子的合成和降解、能量代謝相關(guān)分子、膜轉(zhuǎn)運蛋白、調(diào)控因子、毒力、其它類和功能未知的蛋白等7類,篩選所得序列參與了細(xì)菌在體內(nèi)生長、繁殖和致病等相關(guān)的過程。
　　 3.實時熒光定量PCR檢測腸炎沙門菌感染相關(guān)因子的體內(nèi)外表達(dá)差異
　　 本實驗采用SYBR(R)Green實時定量PCR(qRT-PCR)法,通過相對定量分析(2-△△CT)來比較目的基因體內(nèi)外基因轉(zhuǎn)錄水平差異。根據(jù)IVIAT篩選得

6、到的43個編碼序列,按其類別隨機(jī)選取10個基因(bigA、metQ、SEN3752、fadJ、rlpA、gipA、SEN2804、SEN3610、nadR和ssaD)進(jìn)行試驗。以CMCC50041靜脈接種雞,分別在感染后12、24、36和48hr檢測上述基因在雞體內(nèi)的表達(dá)情況。結(jié)果顯示:除基因fadJ外,大部分基因在這四個時間段的mRNA水平相對于體外均有所上調(diào)。其中,多數(shù)基因在體內(nèi)表達(dá)呈現(xiàn)一種波動性,如metQ、bigA、glpA、S