利用IVIAT技術(shù)篩選雞白痢沙門菌體內(nèi)感染相關(guān)因子及pSPI12質(zhì)粒的鑒定與IpaJ蛋白的功能分析.pdf

1、雞白痢沙門菌多侵害20日齡以內(nèi)的幼雛，引起白色下痢，病死率極高。成年雞感染后雖然不會(huì)出現(xiàn)典型的臨床癥狀，但是長(zhǎng)期處于帶茵狀態(tài)。在成年雞的脾臟和生殖道內(nèi)，細(xì)菌可以存活40周以上。在性成熟時(shí)期，細(xì)菌能侵入卵巢和輸卵管，垂直傳播給下一代。由于該菌能水平傳播和垂直傳播，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)可造成極大的危害。目前，在西方發(fā)達(dá)國(guó)家該病已經(jīng)被消滅或基本消滅，然而在個(gè)別小的禽群中仍有發(fā)生，國(guó)內(nèi)禽群雞白痢的爆發(fā)仍較多。尋求雞白痢沙門菌的致病基因?qū)τ诹私馄渲虏C(jī)理及有

2、效地防治雞白痢具有重要的意義。本研究運(yùn)用IVIAT(in vivoinduced antigen technology)篩選和鑒定了雞白痢沙門菌的感染相關(guān)因子，為全面認(rèn)識(shí)雞白痢沙門菌的致病機(jī)理提供了基礎(chǔ)。
　　 沙門菌毒力質(zhì)粒在細(xì)菌致病過程中發(fā)揮著重要的作用，本研究從雞白痢沙門菌分離鑒定了一個(gè)新的質(zhì)粒pSPI12，并分析了該質(zhì)粒上唯一的毒力相關(guān)基因ipaJ的功能，為深入了解細(xì)菌早期的感染機(jī)制提供了有利的材料。
　　 1.

3、雞白痢沙門菌S06004基因組表達(dá)文庫的構(gòu)建
　　 作為禽的主要病原菌之一，雞白痢沙門菌的致病機(jī)理仍不是很清楚。本實(shí)驗(yàn)采用IVIAT(體內(nèi)抗原誘導(dǎo)技術(shù))篩選雞白痢沙門菌的體內(nèi)感染相關(guān)因子，以了解細(xì)菌體內(nèi)的基因表達(dá)情況。首先，要構(gòu)建雞白痢沙門菌的基因組表達(dá)文庫。將S06004的基因組用Sau3AI酶切后，回收大小在0.1 kb-4 kb的片段。同時(shí)用BamHI酶切原核系列表達(dá)載體(pET30a，b,c)，去磷酸化后，回收線性載體片

4、段。將基因組酶切的片段按適當(dāng)?shù)谋壤c原核表達(dá)載體連接后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，挑取部分轉(zhuǎn)化子，液體培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，用載體特異性引物分析插入片段的大小分布和片段的插入率。然后從平板上提取質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，構(gòu)建了S06004基因組的原核表達(dá)文庫。
　　 2.利用IVIAT技術(shù)篩選雞白痢沙門菌的感染相關(guān)因子
　　 獲取了十份感染了雞白痢沙門菌的陽性血清，混合后分步與S06004體外培養(yǎng)狀態(tài)下表達(dá)的抗原

5、結(jié)合去除相應(yīng)的抗體，同時(shí)利用間接ELISA檢測(cè)吸附效果。然后將經(jīng)過吸附處理的血清與S06004基因組表達(dá)文庫進(jìn)行免疫篩選，經(jīng)初次篩選和二次篩選以后，共篩選出45個(gè)陽性克隆。對(duì)陽性克隆測(cè)序后，分析其中所包含的蛋白序列。篩選獲得的蛋白涉及生物大分子合成和代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、調(diào)控因子、能量代謝相關(guān)蛋白及功能未知蛋白等，反映了細(xì)菌在體內(nèi)感染過程中，除毒力基因的表達(dá)外，細(xì)菌需要表達(dá)相關(guān)蛋白維持正常的生長(zhǎng)代謝和應(yīng)對(duì)體內(nèi)不斷變化的體內(nèi)環(huán)境，為揭示細(xì)菌的體

6、內(nèi)活動(dòng)提供了依據(jù)。
　　 3.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)雞白痢沙門菌S06004感染相關(guān)因子的體內(nèi)外表達(dá)差異
　　 根據(jù)IVIAT篩選獲得的陽性克隆的序列和蛋白序列同源比對(duì)結(jié)果，設(shè)計(jì)了11對(duì)S06004感染相關(guān)因子(traV、gatD、pbpC、stbC、deoR、emrB、dapA、phoQ、trkH、adhE、yhaN)的檢測(cè)引物，同時(shí)以雞傷寒沙門菌gmk基因作為內(nèi)參。提取雞白痢沙門菌S06004體外液體LB培養(yǎng)的總RN

7、A，反轉(zhuǎn)錄成cDNA；以SPF雞為動(dòng)物模型，采用靜脈注射的方式將體外培養(yǎng)的S06004細(xì)菌免疫，感染后在不同時(shí)間段采血，從血液中收集細(xì)菌，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用熒光定量PCR比較感染因子在體內(nèi)外培養(yǎng)時(shí)mRNA的表達(dá)水平差異。結(jié)果表明：個(gè)別基因表現(xiàn)出很高的表達(dá)量，如phoQ;部分基因表達(dá)呈持續(xù)上升趨勢(shì)如gatD;traV、dapA、deoR、emrB和trkH呈先升后降趨勢(shì)；adhE、pbpC和stbC呈下降趨勢(shì)；yhaN呈

8、先降后升趨勢(shì)。反映了各感染相關(guān)因子在體內(nèi)感染不同時(shí)間段mRNA水平并不一致，其表達(dá)水平相對(duì)于體外培養(yǎng)時(shí)有不同程度的上調(diào)。
　　 4.雞白痢沙門菌pSPI12質(zhì)粒的分離與序列分析
　　 利用抑制差減雜交的方法，構(gòu)建了雞白痢沙門菌與腸炎沙門菌的差減文庫，篩選獲得了雞白痢沙門菌的特異核苷酸序列。部分序列拼接形成ipaJ基因與豬霍亂沙門菌C500減毒株質(zhì)粒pSFD10中的ipaJ高度同源。為了驗(yàn)證雞白痢沙門菌ipaJ基因是否存在

9、于類似的質(zhì)粒上，我們將卡那霉素抗性基因插入雞白痢沙門菌S06004株的ipaJ基因中，構(gòu)建了插入突變株SIM12。從突變株中提取質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a，卡那霉素抗性篩選陽性克隆，從中提取質(zhì)粒獲得了攜帶ipaJ基因的質(zhì)粒pSPI12，將質(zhì)粒構(gòu)建到pMD18T載體上測(cè)序分析獲得了pSPI12的完整序列和圖譜。同源性分析顯示pSPI12和pSFD10高度同源，兩者都含有一個(gè)毒力相關(guān)基因ipaJ。 PCR鑒定結(jié)果顯示本室保存的105株雞白痢

10、沙門茵分離株都含有該基因，除了豬霍亂沙門菌C500疫苗株外，其它豬霍亂沙門菌菌株和其它血清型腸道沙門菌亞種中未擴(kuò)增出目的基因。Southernblot分析表明ipaJ基因只存在于質(zhì)粒上。pSFD10是ColE型質(zhì)粒，可以在F質(zhì)粒的介導(dǎo)下進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移，所以我們推測(cè)豬霍亂沙門菌C500中的pSFD10質(zhì)?？赡苡呻u白痢沙門菌中的pSPI12轉(zhuǎn)移后部分堿基突變所致。
　　 5.雞白痢沙門菌IpaJ蛋白功能的初步分析
　　 志賀氏

11、菌中的ipa負(fù)責(zé)編碼侵襲素，參與調(diào)控細(xì)菌侵入細(xì)胞的過程。為了探究雞白痢沙門菌中IpaJ蛋白的功能，構(gòu)建了攜帶有ipaJ基因的回復(fù)質(zhì)粒PCR(R)2.1-ipaJ,電轉(zhuǎn)化入ipaJ基因突變株SIM12株中，獲得了回復(fù)株SIM12(ipaJ)。以禽腎臟上皮細(xì)胞(CKC)為上皮細(xì)胞感染模型，比較了S06004株、SIM12株和SIM12(ipaJ)株對(duì)細(xì)胞的侵襲能力和在細(xì)胞內(nèi)的增殖差異，結(jié)果顯示突變株的侵襲能力和在胞內(nèi)的增殖能力明顯低于野生株

12、和回復(fù)株。由于雞白痢沙門菌以脾臟巨噬細(xì)胞作為其寄生場(chǎng)所，本研究以禽巨噬細(xì)胞系HD-11為巨噬細(xì)胞感染模型，比較三株細(xì)菌對(duì)細(xì)胞侵襲和在胞內(nèi)增殖能力的差異，突變株的侵襲能力都明顯低于野生株和回復(fù)株，但在巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖趨勢(shì)沒有明顯差異，都是從感染后開始到5 hr呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，5 hr后胞內(nèi)的細(xì)菌數(shù)開始下降。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)分析比較了野生株、突變株和回復(fù)株對(duì)10日齡海蘭白蛋雞的致病能力，突變株的致死率與野生株相比降低了約14倍，而回復(fù)株和野生株相當(dāng)。從

13、感染的巨噬細(xì)胞和雞的脾臟細(xì)胞中提取總RNA，利用RT-PCR從感染了S06004的細(xì)胞總RNA中擴(kuò)增出ipaJ基因，表明在感染過程中該基因得到了表達(dá)。Western-blot實(shí)驗(yàn)顯示了體外表達(dá)的IpaJ蛋白可以與雞白痢沙門菌陽性血清反應(yīng)，進(jìn)一步說明IpaJ蛋白可能參與了雞白痢沙門菌對(duì)機(jī)體的感染過程，該基因的突變會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌毒力的降低。
　　 綜上所述，本研究利用IVIAT技術(shù)篩選獲得了雞白痢沙門菌體內(nèi)感染過程中表達(dá)的感染相關(guān)因子，

14、45個(gè)蛋白功能涉及細(xì)菌生物大分子的合成和降解、調(diào)控蛋白、運(yùn)輸?shù)鞍?、能量代謝相關(guān)蛋白、噬菌體功能相關(guān)蛋白和未知功能蛋白等。選取11個(gè)因子進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，結(jié)果顯示在體內(nèi)感染過程中，這些基因的表達(dá)量與體外培養(yǎng)狀態(tài)相比，都有一定程度的上調(diào)。本研究從雞白痢沙門菌中分離出了一個(gè)新的質(zhì)粒pSPI12，大小為4080 bp。序列分析顯示該質(zhì)粒上存在細(xì)菌毒力相關(guān)基因ipaJ，其編碼蛋白可能參與了細(xì)菌早期感染侵襲細(xì)胞的過程。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示ipaJ