利用SCOTS技術(shù)篩選腸炎沙門(mén)菌在不同源巨噬細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄序列.pdf

1、腸炎沙門(mén)菌是一種對(duì)人類(lèi)和動(dòng)物都有高致病性的沙門(mén)菌血清型，與人類(lèi)感染關(guān)系密切，是重要的食源性病原菌和人畜共患菌。食入被污染的肉制品（主要是禽類(lèi)）及蛋制品是人類(lèi)腸炎沙門(mén)菌病爆發(fā)的主要危險(xiǎn)因素之一。腸炎沙門(mén)菌感染人類(lèi)主要表現(xiàn)為以小腸結(jié)腸炎為代表的胃腸道疾病。通常，這類(lèi)感染具有自身限制性并且在3-5天內(nèi)被清除。腸炎沙門(mén)菌感染兩周齡以?xún)?nèi)的禽類(lèi)則表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀和高水平的死亡率，同時(shí)腸炎沙門(mén)菌能侵襲產(chǎn)蛋母雞造成全身性感染并傳遞給子代。目前，對(duì)腸

2、炎沙門(mén)菌致病機(jī)制的研究雖然有一定的進(jìn)展，但仍處于初級(jí)階段。因此，尋求腸炎沙門(mén)菌潛在的致病基因?qū)τ诹私馄渲虏C(jī)理及有效地防治腸炎沙門(mén)菌病都具有重要的意義。本研究運(yùn)用SCOTS(selectivecaptured of transcribed sequences)篩選和鑒定了腸炎沙門(mén)菌在感染禽源和鼠源巨噬細(xì)胞過(guò)程中腸炎沙門(mén)菌的轉(zhuǎn)錄序列，為全面認(rèn)識(shí)腸炎沙門(mén)菌的致病機(jī)理提供了基礎(chǔ)。
　　1.選擇性捕獲腸炎沙門(mén)菌在不同源巨噬細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄序列

3、
　　選取鼠源巨噬細(xì)胞RAW264.7和禽源巨噬細(xì)胞HD-11作為細(xì)胞模型，比較并分析了腸炎沙門(mén)菌C50041菌株對(duì)兩種細(xì)胞的侵染能力及胞內(nèi)的增殖變化趨勢(shì)。結(jié)果顯示:腸炎沙門(mén)菌對(duì)禽源巨噬細(xì)胞的侵染率高于鼠源巨噬細(xì)胞，且腸炎沙門(mén)菌在兩種不同源巨噬細(xì)胞內(nèi)的增殖趨勢(shì)存在明顯的差異。在此基礎(chǔ)上，利用選擇性捕獲轉(zhuǎn)錄序列技術(shù)(SCOTS)篩選細(xì)菌感染巨噬細(xì)胞2hr時(shí)的表達(dá)序列，通過(guò)cDNA序列同源性比對(duì)分析蛋白的功能。結(jié)果顯示:在侵染禽源巨噬

4、細(xì)胞和鼠源巨噬細(xì)胞過(guò)程中分別篩選獲得了58個(gè)和54個(gè)轉(zhuǎn)錄序列。其中包括毒力基因、代謝相關(guān)基因、環(huán)境適應(yīng)性相關(guān)基因、分子合成和降解相關(guān)基因、調(diào)控基因、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因和功能未知基因。研究顯示腸炎沙門(mén)菌在感染不同源巨噬細(xì)胞過(guò)程中，除個(gè)別表達(dá)序列相同，多數(shù)表達(dá)序列存在明顯差異，為揭示腸炎沙門(mén)菌對(duì)不同宿主的致病機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)和依據(jù)。
　　2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)SCOTS篩選序列在細(xì)菌感染過(guò)程中的表達(dá)情況
　　本研究采用SYB

5、R(R)Green實(shí)時(shí)定量PCR方法，通過(guò)相對(duì)定量分析(2-ΔΔCT)來(lái)比較腸炎沙門(mén)菌感染巨噬細(xì)胞2hr和在胞內(nèi)增殖5hr時(shí)，腸炎沙門(mén)菌在細(xì)胞內(nèi)mRNA轉(zhuǎn)錄水平與體外的差異。根據(jù)SCOTS篩選結(jié)果，我們隨機(jī)從腸炎沙門(mén)菌感染HD-11中篩選所得的58個(gè)序列中隨機(jī)選取12個(gè)基因（invJ、ycaM、 bigA、SEN4299、SEN3610、SEN0988、nlpB、SEN2555、SEN0815、SEN2967、stdB和yiaG），從腸

6、炎沙門(mén)菌感染RAW264.7中篩選所得的54個(gè)序列中選取12個(gè)基因(dnaG、cbiK、rbfA、copS、rseB、rtcR、rfaQ、secG、spvB、flgX、lpfC和phoB)，檢測(cè)其在HD-11和RAW264.7中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，所有基因在兩種巨噬細(xì)胞中都得到了表達(dá)，證明了SCOTS技術(shù)的可靠性。同時(shí)，檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，除個(gè)別基因在胞內(nèi)表達(dá)水平與體外培養(yǎng)過(guò)程中不存在差異，多數(shù)基因在感染細(xì)胞過(guò)程中表達(dá)明顯上調(diào)。其中，細(xì)菌侵

7、染HD-11過(guò)程中篩選的基因在感染HD-112 hr時(shí)的表達(dá)量均低于增殖5hr的量，而在RAW264.7中，各基因仍表達(dá)，且表達(dá)量與在HD-11中無(wú)顯著差異。而細(xì)菌侵染RAW264.7過(guò)程中篩選的基因在感染RAW264.72 hr時(shí)的表達(dá)量與增殖5hr時(shí)無(wú)顯著差異，但在HD-11中，各基因的表達(dá)量顯著下調(diào)，尤其是在增殖5hr點(diǎn)，其表達(dá)量下降水平明顯。此外，部分基因在細(xì)菌感染細(xì)胞的過(guò)程中上調(diào)表達(dá)水平達(dá)到20倍以上，有的甚至達(dá)到100倍，對(duì)