食品沙門菌限量標(biāo)準及腸炎沙門菌脈沖場凝膠電泳分型技術(shù)研究.pdf

1、微生物引起的食源性疾病已成為一個全球性的公共衛(wèi)生問題，而沙門菌導(dǎo)致的食物中毒又居各種微生物之首。據(jù)統(tǒng)計，我國細菌性食物中毒中，有70％～80％是由沙門菌引起，而引起沙門菌中毒的食品，約90％是肉、蛋、奶等動物性食品。涉及數(shù)百人發(fā)病的沙門菌食物中毒年年都有發(fā)生，嚴重危害人民群眾的身體健康，造成極大的經(jīng)濟損失和嚴重的社會影響。 許多國家的食品衛(wèi)生標(biāo)準已經(jīng)是按照食品的種類和特色分項制定致病菌的標(biāo)準，很多新食源性致病菌已經(jīng)被列入標(biāo)準進行

2、檢驗和控制。而目前我國食品中有害微生物的限量標(biāo)準存在很大空白，現(xiàn)存標(biāo)準在許多方面與國際標(biāo)準不接軌。隨著加入WTO，這樣的限量標(biāo)準一方面不利于我國的進出口貿(mào)易，另一方面也不利于控制產(chǎn)品質(zhì)量，保障人群健康。因此迫切需要我們規(guī)范現(xiàn)有的食品微生物檢驗采樣方法、采樣量、檢樣量、操作過程和檢測方法，制修訂與國際接軌的檢測主要食品中有害微生物的方法及其限量標(biāo)準。本研究以沙門菌為例，對比分析了國內(nèi)外食品中沙門菌的限量標(biāo)準和檢測方法，以期為我國標(biāo)準的制修

3、訂提供參考。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：(1)目前國際上大多數(shù)的國家均采用國際微生物規(guī)格委員會(IntemationalCommission on Microbiological Specifications for Foods，ICMSF)的采樣方案，而對于食品中沙門菌的限量標(biāo)準幾乎全部是0cfu，且通常為0cfu／25g(或25mL)；(2)沙門菌的檢測方法多種多樣，但傳統(tǒng)的增菌培養(yǎng)法仍被所有國家采納作為其官方方法。我國檢測方法與國外方法的不同之處主

4、要在于樣品的前處理過程和培養(yǎng)基的選擇。 DNA大限制性片斷分析是用限制性內(nèi)切酶在短時間內(nèi)酶切基因組DNA，這樣會產(chǎn)生少量的限制性片斷(通常是10～20個)，并根據(jù)片斷的不同對DNA大分子進行鑒定。然而這些片斷通常太大，常規(guī)瓊脂糖凝膠電泳不能分離，1984年提出的脈沖場凝膠電泳(pulsed-field gelelectrophoresis，PFGE)，通過在凝膠上外加正交的變脈沖電場，使35～10,000kb的DNA分子在凝膠中

5、也能得到有效分離。該法可以快速將來自病人或可疑食品樣本的細菌PFGE試驗結(jié)果進行比較，根據(jù)來自同一親代的個體具有共同的遺傳物質(zhì)，故此可在PFGE試驗中表現(xiàn)出相同的指紋圖譜這一原理，確定致病菌的親緣關(guān)系，追溯共同的致病食品源頭所在。本研究選用了經(jīng)生化反應(yīng)、血清學(xué)及PCR方法鑒定的腸炎沙門菌，用營養(yǎng)肉湯增菌后，菌液經(jīng)離心后包埋于等量的瓊脂糖中，加入模具制成膠塊，再用溶菌酶、蛋白酶K處理后，用XbaI、Spel在短時間內(nèi)酶切基因組DNA，以產(chǎn)

6、生少量的大限制性片斷，并對其進行脈沖場凝膠電泳。為了達到良好的分辨效果，在試驗中設(shè)置了多種電泳參數(shù)，并對其進行優(yōu)化。最終選定Xbal酶切后的PFGE電泳參數(shù)為1％瓊脂糖、0.5×TBE緩沖液、14℃、6v／cm、120°、4h(25～65s)、14h(5～24s)；Spel酶切后的PFGE電泳參數(shù)為1％瓊脂糖、0.5×TBE緩沖液、14℃、6v／cm、120°、4h(25～65s)、16h(2～24s)。結(jié)果顯示，經(jīng)XbaI、SpeI酶